Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali<em> In Vitro</em> È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale Modello
Summary
Esecuzione di test di coltura cellulare per indagare adesione batterica e l'invasione in condizioni aerobiche è di solito non rappresentativo della<em> In vivo</em> Ambiente. Un modello di camera di diffusione verticale permette lo studio delle interazioni del patogeno umano<em> Campylobacter jejuni</em> Con le cellule epiteliali intestinali in più<em> In vivo</em> Condizioni simili, con conseguente maggiore invasione batterica.
Abstract
Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Abbiamo sviluppato un modello in vitro di infezione che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas. La camera di diffusione verticale (VDC) modello simula le condizioni nell'intestino umano, dove i batteri saranno in condizioni di tessuto, mentre molto basso di ossigeno sarà fornita con l'ossigeno dal flusso sanguigno. Posizionamento polarizzati cellulari (IEC) monostrati epiteliali intestinali cresciute in Snapwell inserisce in un VDC crea compartimenti apicale e basolaterale separati. Il vano basolaterale è riempito con mezzo di coltura cellulare, sigillato e perfusi con l'ossigeno wHilst compartimento apicale è pieno di brodo, tenute aperte e incubate in condizioni microaerobiche. Sia Caco-2 e T84 IECs possono essere mantenuti nel VDC in queste condizioni, senza apparenti effetti negativi sulla sopravvivenza delle cellule o l'integrità monostrato. Esperimenti Coculturing eseguiti con differenti C. jejuni ceppi wild-type e diverse linee IEC nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale riproducibile risultano in un incremento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche 1. L'ambiente creato nel modello VDC imita più da vicino l'ambiente incontrate da C. jejuni nell'intestino umano e mette in evidenza l'importanza di esibirsi de saggi di infezione in vitro in condizioni che mimano più da vicino la realtà in vivo. Noi proponiamo che l'uso del modello VDC consentirà nuove interpretazioni delle interazioni scommettonoween batteri patogeni e cellule ospiti.
Introduction
Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. L'uso di tali saggi di coltura cellulare, adesione batterica alle cellule ospiti, l'identificazione dei recettori della cellula ospite, cellula ospite vie di segnalazione e l'invasione batterica delle cellule ospiti sono stati tutti studiati in dettaglio, con conseguente molte importanti osservazioni. Tuttavia tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche che possono non essere rappresentativi della ambiente in vivo. Una limitazione importante di modelli in vitro utilizzati per studiare le infezioni gastrointestinali è che le condizioni di coltura tra cui alti livelli di ossigeno in generale favoriscono la sopravvivenza delle cellule eucariotiche. Tuttavia le condizioni nel lume intestinale saranno quasi anaerobica. Patogeni enterici in un ambiente povero di ossigeno esprimono geni di virulenza cui espressione cambia in condizioni aerobiche 2. Come tale, i dati ottenuti utilizzando standard di coltura cellulare modelli may dare un'indicazione imprecisa delle interazioni batteriche con le cellule ospiti.
Campylobacter jejuni è il principale agente eziologico della gastroenterite acuta batterica in tutto il mondo, con sintomi che vanno dalla diarrea lieve a grave enterite infiammatoria. La maggioranza di C. jejuni infezioni provocano gastroenterite non complicata, tuttavia C. jejuni è anche l'agente infettivo più comunemente identificato in neuropatie periferiche, incluse la sindrome di Guillain-Barré (GBS). Nel Regno Unito, si stima che ci siano oltre 500.000 casi di enteriti causate da C. jejuni infezione ogni anno, con un costo previsto per l'economia del Regno Unito di £ 580.000.000. Nel mondo in via di sviluppo, C. jejuni è una delle principali cause di mortalità tra i bambini. Nonostante l'indubbia importanza di infezione da Campylobacter e di decenni di ricerca, tra cui l'analisi genomica basata approfondita, C. jejuni patogenesi è ancora poco understood, a differenza di altri patogeni enterici come Salmonella, Escherichia coli, Shigella e Vibrio cholerae. La mancanza di un comodo piccolo modello animale è una delle ragioni principali per questo 3. Anche il ampiamente utilizzato de modelli di infezione in vitro sono più appropriati per lo studio microaerofili C. jejuni che per altri patogeni enterici che sono anaerobi facoltativi. Mentre C. jejuni è riconosciuto come un agente patogeno invasivo, i meccanismi di C. jejuni invasione delle cellule epiteliali intestinali (IECs) sono ancora poco chiari 4,5. C. jejuni invasione ha dimostrato di essere dipendente sia microfilamenti, microtubuli, una combinazione di entrambi o nessuno 5. La confusione in questa zona è molto probabilmente dovuta all'uso di appropriati nelle condizioni di saggio in vitro.
Un certo numero di differenti saggi di coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare le interazioni di C. jejunicon le cellule ospiti. Caco-2 6, 7 INT 407 e T84 8 linee cellulari sono stati tutti utilizzati per studiare le capacità di adesione e invasione di diversa C. ceppi jejuni. Tuttavia, i livelli di adesione batterica e invasione per C. jejuni con IECs sono notevolmente inferiori rispetto ad altri patogeni enterici 9. La coculturing di C. jejuni con IECs viene normalmente eseguita in un incubatore CO 2 in condizioni vicine a livelli di ossigeno atmosferico, necessaria per la sopravvivenza di IECs. C. espressione genica jejuni sarà molto differente nell'ambiente ossigeno basso del lume intestinale rispetto a condizioni di ossigeno atmosferico.
L'uso di un sistema di camera di diffusione verticale (VDC) è stato sviluppato che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas 1,10,11. Questo sistema simula le condizioni nell'intestino umano, dove i batteri saranno ONUder condizioni di tessuto mentre molto basso ossigeno saranno forniti con l'ossigeno dal flusso sanguigno. Monostrati polarizzati IEC coltivate in speciali 0,4 micron filtri sono stati collocati in un VCC creando un compartimento apicale e basolaterale, che sono stati riempiti singolarmente con brodo batterica e coltura cellulare rispettivamente (Figura 1). Il VDC è stata posta in atmosfera variabile incubatore contenente 85% N 2, O 2 5%, e 10% di CO 2 a 37 ° C, con condizioni ottimali per C. jejuni. Il compartimento apicale stata lasciata aperta ed esposta all'atmosfera microaerobica all'interno della variabile atmosfera incubatrice, mentre il vano basolaterale sigillata è stata fornita con l'ossigeno da una costante somministrazione di 5% 95% O 2 miscela di gas con un tubo di uscita evitando accumuli di pressione CO 2 / . Caco-2 sopravvivenza cellulare e integrità monostrato in queste condizioni sono state confermate dal monitoraggio ele transepitelialeResistenza ctrical (TEER) attraverso il monostrato oltre 24 ore per dimostrare sopravvivenza della separazione Caco-2 monostrato cellulare e fisica dei compartimenti apicale e basolaterale in condizioni di bassa ossigeno nel compartimento apicale. La TEER di monostrati in VDCs mantenuto in atmosfera incubatrice variabile (condizioni microaerobiche) ed in una coltura cellulare di CO 2 incubatore standard (condizioni aerobiche) non ha evidenziato differenze significative, indicando integrità del monostrato cellulare in diverse condizioni meteorologiche 1. In condizioni microaerobiche, giunzioni strette sono rimasti presenti e uniformemente distribuito tra i bordi delle celle con un pattern di colorazione occludina simili alle cellule mantenute in condizioni aerobiche 1.
Le interazioni di C. jejuni con Caco-2 e T84 cellule del VDC sono stati studiati per valutare l'interazione batterica (adesione e invasione) e l'invasione. Due diversi C. jejuni wild-type straiNS sono stati utilizzati 1. C. jejuni 11168H è un derivato hypermotile dell'originale ceppo sequenza NCTC11168. Il ceppo 11168H mostra molto più alti livelli di colonizzazione in un modello di colonizzazione pulcino ed è quindi considerato un ceppo adatto da utilizzare per studi di interazione ospite-patogeno. 81-176 è un umano isolare ed è uno dei più invasive ceppi di laboratorio ampiamente studiate. C. jejuni ceppi sono stati aggiunti al compartimento apicale di un VDC in condizioni sia microaerobiche o aerobico. Abbiamo osservato tassi più elevati sia per l'interazione e l'invasione sono stati registrati per C. jejuni in condizioni microaerobiche 1. L'aumento C. interazioni jejuni non erano dovuti ad un aumento del numero di batteri in condizioni microaerobiche 1. Questi dati supportano la nostra ipotesi che l'ambiente a basso ossigeno nel compartimento apicale del VDC migliora interazioni batteri-ospite e indica che le proprietà invasive di C. jejuni sono incrfacilitato in queste condizioni. Questo era il primo rapporto di utilizzo del modello VCC per studiare un patogeno batterico invasiva e mette in evidenza l'importanza di eseguire saggi di infezione in vitro in condizioni che imitare maggiormente la situazione in vivo. Il modello VDC potrebbe essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per molte differenti specie batteriche.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso di metodi di coltura cellulare in vitro per studiare le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti è una tecnica largamente impiegata in molti laboratori di ricerca. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Il ampiamente usato de modelli di infezione in vitro sono partic…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dominic Mills è stato sostenuto da un Bloomsbury Collegi PhD Studentship (2007-2010). Gli autori desiderano ringraziare sia Ozan Gundogdu e Abdi Elmi per la loro assistenza nello sviluppo del modello VDC.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
Referencias
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