Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica
Summary
Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.
Abstract
Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.
Introduction
Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica 1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio 2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados 11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo 14 e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores 15.
.Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As micro…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 08UDE017788-05). EBP também reconhece o apoio da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT). Os autores agradecem a Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti para a leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Referencias
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
