Summary

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Published: August 16, 2013
doi:

Summary

Se describe un método de imagen no invasiva para distinguir las fases inflamatorias. El suministro sistémico de luminol revela zonas de inflamación aguda que dependen de la actividad MPO en neutrófilos. En contraste, la inyección de lucigenina permite la visualización de la inflamación crónica dependiente de la actividad Phox en los macrófagos.

Abstract

La inflamación es un aspecto fundamental de muchas enfermedades humanas. En este informe de vídeo, se demuestra las técnicas de imagen no invasivas bioluminiscencia que distinguen a la inflamación aguda y crónica en modelos de ratón. Con daños en los tejidos o la invasión de patógenos, los neutrófilos son la primera línea de defensa, jugando un papel importante en la mediación de la respuesta inflamatoria aguda. A medida que avanza la reacción inflamatoria, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros, que median la inflamación crónica y promover la reparación del tejido mediante la eliminación de restos de tejido y la producción de citocinas antiinflamatorias. La inyección intraperitoneal de luminol (,4-ftalazinediona, sal de sodio de 5-amino-2 ,3-dihidro-1) permite la detección de la inflamación aguda en gran parte mediada por neutrófilos infiltrantes de tejidos. Luminol reacciona específicamente con el superóxido generado dentro de los fagosomas de neutrófilos desde bioluminiscencia resulta de una mieloperoxidasa (MPO) reacción mediada. Lucigenin (bis-N-metilacridinio nitrato) también reacciona con el superóxido con el fin de generar bioluminiscencia. Sin embargo, lucigenin bioluminiscencia es independiente de MPO y se basa únicamente en la NADPH oxidasa de fagocitos (Phox) en los macrófagos durante la inflamación crónica. Juntos, el luminol y lucigenina permiten la visualización no invasiva y la evaluación longitudinal de diferentes poblaciones fagocitos a través de fases inflamatorias tanto agudas como crónicas. Teniendo en cuenta el importante papel de la inflamación en una variedad de enfermedades humanas, creemos que este método de formación de imágenes no invasiva puede ayudar a investigar los papeles diferenciales de los neutrófilos y macrófagos en una variedad de condiciones patológicas.

Introduction

La inflamación es una respuesta biológica altamente regulado que participan en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo la infección microbiana 1, cicatrización de la herida 2, 3 la diabetes, el cáncer de 4, 5 cardiovasculares, neurodegenerativas 6, 7 y enfermedades autoinmunes. Inflamación de tejidos requiere la coordinación adecuada de diversas células inmunes con el fin de lograr la autorización patógeno, la reparación de tejidos, y la resolución de la enfermedad. Los neutrófilos y los macrófagos son mediadores inmunes clave de la inflamación del tejido. En la fase aguda de la inflamación, los neutrófilos son los primeros en responder a diversos estímulos nocivos y daños en los tejidos 8. Los neutrófilos extravasación rápidamente de la circulación para el sitio de la lesión, donde las células inactivan los microbios invasores mediante la liberación de gránulos anti-microbianos y la fagocitosis. Durante la fagocitosis, neutrófilos fagocitan los microbios invasores en fagosomas, dentro de la cual las células producen niveles elevados de superóxidoide (O 2 · -). Superóxido phagosomal es la fuente principal de muchas especies reactivas de oxígeno (ROS aguas abajo). Por ejemplo, se puede dismutado superóxido a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) por dismutación espontánea o por la superóxido dismutasa (SOD) 9, 10. En los neutrófilos, la mieloperoxidasa (MPO) convierte más peróxido de hidrógeno a ácido hipocloroso antimicrobiana (HOCl) 11. Como las respuestas inflamatorias siguen, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros 2, cuya función fagocítica ayudar a eliminar patógenos inactivados y restos celulares. Además, como un regulador clave en la última fase de la inflamación, los macrófagos promueve la reparación del tejido mediante la producción de citocinas antiinflamatorias y 12 mediante la generación de ROS extracelular a un nivel inferior 9. El ROS generado en esta etapa posterior a regular la remodelación de tejidos, formación de nuevos vasos, y reepithelialización 13.

Fagocito NADPH oxidasa (Phox) es la fuente primaria de la producción de superóxido en neutrófilos y macrófagos 9. Phox es un complejo multi-subunidad cuyo montaje es estrictamente regulados 9. La holoenzima contiene varias subunidades reguladoras citosólicas (p67 phox, p47 phox, p40 phox y RAC) y una membrana heterodímero citocromo b 558 (compuesto por subunidades CYBA y CYBB). Citocromo b 558 es el núcleo de reacción dentro de la cual la subunidad CYBB (también conocido como p91 phox y NOX2) lleva a cabo la reacción en cadena redox primaria 9. Curiosamente, sus lugares de concentración son diferentes entre los neutrófilos y los macrófagos. En los neutrófilos en reposo, el citocromo b 558 es sobre todo presente en la membrana de los gránulos de almacenamiento intracelular 14. Durante la fagocitosis, neutrófilos montar la holoenzymes en fagosomas 9, donde también están presentes altos niveles de actividad de MPO. El neutrófilo Phox consume rápidamente oxígeno y ejerce su poder microbicida por la producción de ROS, un fenómeno denominado el estallido respiratorio 11. En contraste, los macrófagos tienen un nivel más bajo de expresión de MPO y el citocromo b 558 se encuentra principalmente en la membrana de plasma 15, 16. Por lo tanto los neutrófilos producen altos niveles de superóxido para la actividad anti-microbiana, mientras que los macrófagos generan menos superóxido para las funciones de regulación 15.

Dado que la inflamación es un intrincado proceso in vivo, los métodos de imagen no invasivas específicos para las diferentes fases de la inflamación serían permiten la evaluación cuantitativa y longitudinal de modelos de enfermedad. Uso de estudios mecanísticos, hemos demostrado previamente el uso de dos agentes quimioluminiscentes, luminol (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-ftalazinediona) y lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para formación de imágenes no invasiva de las etapas agudas y tardías (crónica) de la inflamación, respectivamente 17. Luminol permite la visualización de la actividad de MPO de neutrófilos en la fase aguda de la inflamación 18-20, mientras que la bioluminiscencia lucigenina se puede utilizar para evaluar la actividad de los macrófagos en asociación con la fase tardía o la inflamación crónica 17. En este manuscrito, se utilizaron dos modelos experimentales de inflamación (sc PMA y sc LPS) para demostrar estas técnicas de imagen.

Protocol

Nota: Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con protocolos institucionales aprobados y las directrices de cuidado de animales. 1. Reactivos y Soluciones Solución de PMA para la inoculación sc: Preparar una solución madre de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a 5 mg / ml en DMSO. Guarde la solución madre a -20 ° C. Antes de la inoculación, descongelar la solución madre y se diluye hasta 1 mg / ml de PMA en PBS. Solución de LPS…

Representative Results

Se realizó imágenes de bioluminiscencia longitudinal para evaluar la inflamación aguda y crónica en modelos experimentales de inflamación. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) es un agonista de la proteína quinasa C potente (PKC) que activa Phox para la producción de anión superóxido y desencadena intensas respuestas inflamatorias agudas 21. Inyección subcutánea de 50 mg de PMA en ratones desnudos NCr causó irritación de la piel rápido y la inflamación aguda en los sitios de inyección 18,…

Discussion

En este informe, se demuestra un método para obtener imágenes de bioluminiscencia no invasivo de la inflamación en los animales vivos. Tomando ventaja de dos sustratos luminiscente, el luminol y lucigenina, el método puede distinguir diferentes fases de la inflamación. Bioluminiscencia Luminol se asocia con los neutrófilos en la fase aguda de la inflamación, mientras que la bioluminiscencia lucigenina está mediada por los macrófagos en la fase crónica. Relativamente pequeño (PM = 177,16 g / mol) y no cargado …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nancy Lurie Marcas. Damos las gracias a la Dra. Nancy E. Kohl para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos Kin K. Wong por su ayuda en la preparación de este informe en video.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO P8139  
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO L2012  
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO A4685  
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO M8010  
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA    

Referencias

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Citar este artículo
Tseng, J., Kung, A. L. In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation. J. Vis. Exp. (78), e50690, doi:10.3791/50690 (2013).

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