Kontaktløs dielektroforese (cDEP) opnår sortering og berigelse af partikler via deres iboende dielektriske egenskaber. Fluidic elektrode kanaler erstatte metalelektroder traditionelle til DEP, passer cDEP til ikke-skadelige steril karakterisering og sortering af biologiske partikler. Vi viser, hvordan du forbereder en cDEP microdevice og gennemføre celle karakterisering og sortering eksperimenter.
Dielektroforese (DEP) er det fænomen, som polariserede partikler i en ikke-ensartet elektrisk felt undergår translatorisk bevægelse, og kan anvendes til at styre bevægelsen af mikropartikler i en overflade markør-uafhængig måde. Traditionelt DEP enheder omfatter plane metalelektroder mønstrede i prøven kanal. Denne fremgangsmåde kan være dyrt og kræver en specialiseret rentrumsmiljø. For nylig har en kontakt-fri tilgang kaldet kontaktløs dielektroforese (cDEP) blevet udviklet. Denne metode udnytter den klassiske princip om DEP samtidig undgå direkte kontakt mellem elektroder og prøve ved patterning fluidstyrede elektroder og en prøve kanal fra en enkelt polydimethylsiloxan (PDMS) substrat, og har ansøgning som en hurtig mikrofluid strategi designet til at sortere og berige mikropartikler. Enestående for denne metode er, at det elektriske felt genereres via strømningstekniske elektrode kanaler med en stærkt ledende væske, som er adskilt fraprøve kanal med en tynd isolerende barriere. Fordi metal elektroder ikke direkte kontakt med prøven, er elektrolyse, elektrode delaminering og kontamination prøve undgås. Derudover giver dette en billig og simpel fremstillingsproces.
cDEP er således velegnet til at manipulere følsomme biologiske partikler. Den dielektroforetiske kraft, der virker på partiklerne afhænger ikke kun på rumlige gradienter af det elektriske felt genereres af tilpasses design af indretningen geometri, men de iboende biofysiske egenskaber af cellen. Som sådan cDEP er en etiket-fri teknik, der undgår afhængigt overfladeudtrykte molekylære biomarkører, der kan være variabelt udtryk i en population, mens det stadig tillader karakterisering, berigelse, og sortering af biopartikler.
Her viser vi det grundlæggende i fabrikation og eksperimenter ved hjælp cDEP. Vi forklarer den enkle tilberedning af en cDEP chip bruger blød litografiy teknikker. Vi diskuterer den eksperimentelle fremgangsmåde for karakterisering delefrekvensen af en partikel eller celle, frekvensen, ved hvilken dielektroforetiske kraft er nul. Endelig vil vi demonstrere brugen af denne teknik til sortering af en blanding af kræft i æggestokkene celler og fluorescerende mikrosfærer (perler).
Biologisk prøve berigelse og partikel sortering er ofte nødvendigt for efterfølgende analyse. 1. For eksempel isolering af sjældne celler fra kropsvæsker har vigtige anvendelser i kræft påvisning og individualiseret medicin. 2,3 De mest almindeligt anvendte berigelses teknikker er fluorescerende cellesortering (FACS ) 4 og magnetisk cellesortering (MACS), 5, som afhængige udtrykte overflade markører til at skelne celler. Andre strategier omfatter hydrodynamisk 6 eller inertiel 7,8 sortering, optisk pincet, 9 akustoforese, 10 og dielektroforese. 11,12 dielektroforese er bevægelsen af et polariseret partikel i tilstedeværelse af en uensartet elektrisk felt. 13. DEP har været brugt til en bred vifte af applikationer, 2,14 herunder sortering celler baseret på bæredygtighed, 15. karakteriserer bioelektriske egenskaber af celler, 16 og sorterening på inducerede ændringer i biofysiske egenskaber af celler. 17,18 Traditionelle DEP udnytter plane elektroder mønstrede inden for en mikrofluid kanal til at anvende en spænding og inducere en ikke-ensartet elektrisk felt. 13. Selv om dette er en kraftfuld teknik, kan udfordringer opstår, såsom elektrode delaminering og elektrolyse. Insulator-baserede dielektroforese (IDEP) 19 har taget de udfordringer, begroning, elektrode delaminering og rumlig nedbrydning af elektroden område gennem patterning isolerende strukturer, der inducerer uensartetheder i et DC elektrisk felt. IDEP er blevet anvendt til selektivt at adskille levende og døde bakterieceller, 19 isolere bakteriesporer, 20 og manipulere DNA, 21 blandt andre anvendelser. Joule-opvarmning kan være en udfordring, fordi det kan forekomme som et resultat af de høje DC spændinger ofte påkrævet. For at mildne disse udfordringer, har kontakt-fri DEP microdevices blevet udviklet. 22-24
<p class = "jove_content"> Teknikken præsenteres her udnytter kontaktløse dielektroforese (cDEP), så opkaldt efter den manglende direkte kontakt mellem metalliske elektroder og prøve kanalen. 22. Unikt for denne strategi er udskiftningen af metalliske elektroder med flydende elektrode-kanaler fyldt med en stærkt ledende opløsning. Disse flydende elektroder kapacitivt koblet på tværs af en tynd isolerende barriere til prøven kanal via en AC-spænding. Eliminering prøve kontakt med elektroder reducerer problemer forbundet med DEP-baserede metoder såsom elektrolyse og boble dannelse, forurening prøve og elektrode delaminering. Som et resultat, cDEP er især nyttig for biologiske prøver, fordi det understøtter levedygtigheden af cellerne i prøven. Vigtigt er det, kan cDEP vedligeholde prøve sterilitet. En chip kan tilberedes i en cellekultur hætte og forsøget kan gennemføres uden at kræve prøve kontakt til metal elektroder eller kræver, at prøven være åben for environment. En simpel reservoir kan fastgøres til chip outlet at lette steril af prøven. Desuden fremstilling af væske elektroder fra samme biokompatibel polymer materiale (PDMS) som prøve kanal reducerer den høje omkostning med brugerdefineret mønster af metal elektroder, den nødvendige tid til fremstilling og begrænser behovet for specialiseret renrum udstyr til det oprindelige mønster af den genanvendelige silicium wafer stempel.Bevægelse af partikler på grund af DEP afhænger af egenskaberne af partiklen og medium, samt de rumlige gradienter af det elektriske felt. En partikel-og frekvensafhængig faktor, kaldet Clausius-Mossotti (CM) faktor, tager en værdi i området -0,5 til 1, og bestemmer retningen af DEP kraft. Den frekvens, ved hvilken CM faktor er præcis nul kaldes delefrekvensen. Dette er det punkt, hvor der ikke sker dielektrophoretisk kraft på en partikel og CM faktor ændringer tegn. A sIngle delefrekvens for inaktive faste mikrosfærer opstår, når CM faktor skifter fra negativ til positiv 25 For pattedyrceller i lav ledningsevne buffer i størrelsesordenen 0,01 S / m, en første crossover frekvens indikerer en overgang fra NDEP til pDEP eksisterer nær 10.. – 100 kHz, og er påvirket af størrelse, form, cytoskelettet og membran egenskaber af cellen. 26,27 En anden delefrekvens på et skift fra den pDEP til NDEP regime er på rækkefølgen af 10 MHz, og er påvirket af kerne-cytoplasma ratio cytoplasma ledningsevne og endoplasmatiske reticulum. 27 DEP kraft kan anvendes uden tilstedeværelse af væske flow, men her bruger vi en flydende væske til at opnå vedvarende sortering af suspenderede partikler. Den kombinerede påvirkning af dielektrophoretisk kraft og Stokes 'trækkraften diktere translatoriske bevægelse af en partikel.
Vi har udviklet indretninger til drift i to frekvensområder. Højere frekvenseny enheder (100-600 kHz) har fungeret ved hjælp pDEP og opnåede batch sortering af celler, såsom prostata tumorfremkaldende celler (tics), murine æggestokkene overflade epithelial (Mose) celler, MDA-MB-231 brystkræftceller, eller leve THP -1 celler ved selektivt at fange celler af interesse på isolerende stillinger placeret i prøven kanal. 28-31 lavere frekvens (5-100 kHz) enheder opererer kontinuerligt, og når der drives på en frekvens, ved hvilken en befolkning oplever pDEP mens befolkningen erfaringer baggrund NDEP kan omdirigere partikelbaner at opnå sorting. 32-34 Disse lavfrekvente indretninger er blevet anvendt til at sortere cancerceller fra røde blodlegemer, at bestemme ændringer i de dielektriske egenskaber i en progressiv MOSE cellelinie, og til at belyse virkningerne af ikke- giftige sphingolipid behandlinger på at vende aggressive karakteristika af aggressive Mose celler. Derudover kan cDEP microdevices være designet til at operere på øget gennemløb, i øjeblikket op til 1 ml / hr.. 31,35
Som beskrevet, fleksibilitet og lave omkostninger i produktionsprocessen muliggør custom-designet enhed geometrier, der tillader præsenterede eksperimentelle procedure at være relevante for en bred vifte af applikationer. Det langsigtede mål for cDEP er at realisere etiket-fri celle sortering og berigelse på et klinisk niveau, med prøve opsving for efterfølgende kultur eller forarbejdning. Teknikken præsenteres her er en enkel og billig metode, fra fabrikation til eksperimenter, hvilket øger tilgængeligheden af DEP. Vi demonstrerer udarbejdelse af en cDEP chip og forsøgsprotokollen at opnå karakterisering og berigelse af kræft i æggestokkene celler fra fluorescerende mikrosfærer.
DEP er en kraftfuld teknik til bestemmelse af de dielektriske egenskaber af partikler og lede partikel bevægelse i retning sortering, isolation eller berigelse applikationer. På grund af de skadelige virkninger af direkte elektrode kontakt med en prøve, mens andre har taget tilgange ligner den tidligere præsenterede metode til at undgå kontakt. For eksempel Bashir et al. Udviklet kontaktlister-fri DEP enheder ved hjælp af en mikrofluid PDMS enhed adskilt fra printpladeteknikker elektroder af en tynd dækglas, og denne teknik er også gjort tilgængelig i videoformat. 23,36
Her har vi vist, at fremstillingen af en cDEP chip og strømningstekniske elektroder ved hjælp af en enkelt PDMS substratet og forsøgsprotokollen til separering af ovariecancerceller fra en blanding af celler og fluorescerende kugler. De præsenterede teknik er med succes blevet brugt til en række mere komplekse og fysiologisk relevante anvendelser, herunder sortering live og døde celler, 28 tumorfremkaldende celler fra prostata kræftceller, 30 kræftceller fra fortyndede røde blodlegemer, 31,32 og differentiere mellem stadier af brystkræft 37 og kræft i æggestokkene. 29. cDEP er også blevet brugt til at blande partikler. 38. Disse ansøgninger antyder, at ved hjælp af simpel teknik præsenteres, kan forskellige formål opnås blot ved at ændre udformningen af kanalens geometri.
. DEP er nyttig på mikroskala for manipulation af partikler 13 For sfæriske partikler, den translationelle dielektrophoretisk kraft afhænger af størrelse og elektriske egenskaber af partiklen og dens suspenderingsmedium samt gradienten af det elektriske felt squared:
hvor ε m er permittivitet suspension medium, r er radiusaf partiklen, og Rc [k (ω)] er den reelle del af Clausius-Mossotti (CM) faktor. CM faktor er et mål for den relative polariserbarhed af partiklen i forhold til den suspenderende medium og bestemmer retningen af dielektrophoretisk kraft. Det er beskrevet som
hvor og er komplekse permittivities af partiklen og mellemstore hhv. Den komplekse permittivitet, , Afhænger af ledningsevne (σ) og frekvens (ω). CM faktor sfæriske partikler er teoretisk bundet mellem -0.5 og 1. Hvis CM faktor er negativ, partiklerne oplever NDEP fordi mediet er mere polariserbar end partiklen, så partiklerne bevæger sig væk fra regionerhøje elektriske feltgradienter. Hvis CM faktor er positivt, at partiklerne er mere polariserbar end mellemlang og de oplever pDEP, hvor de bevæger sig mod regioner med høj elektrisk feltgradienter.
For biologiske partikler, som er ikke-homogen struktur, såsom celler, kan Clausius-Mossotti faktor bestemmes ud fra en effektiv værdi for partikel permittivitet:
hvor og er den komplekse permittivitet af den effektive komplekse permittivitet af det indre af cellen, såsom cytoplasmaet og plasmamembranen hhv. r er radius af cellen, og d er tykkelsen af plasmamembranen 26
Når DEP optræder med partikler suspenderet i envæske, vil bevægelse af partiklen i forhold til væsken generere et træk kraft på partiklen. Må anses dette træk kraft, når fastsættelsen af det samlede kraft, der handler på partiklen. For de situationer af interesse her, viskose kræfter dominere og partikler antages sfæriske, lille, og bevæger sig med en relativ lav hastighed, så Stokes 'trække loven giver en god tilnærmelse for træk kraft:
hvor η er viskositeten af fluidet, u p er partiklens hastighed, og u f er hastigheden af væske, som også kan bevæge sig. I betragtning af den dielektroforetiske kraft, der er kendt væske og partikel egenskaber og en kendt strømningshastighed kan balancen mellem trækkraften og dielektroforetiske kraft løses at estimere partikelhastigheden. Den shear rate, at cellerne erfaring skal være under den grænse, hvor ckan forekomme ell lysering.
Karakterisering af de elektriske egenskaber af partikler er nødvendig for at forudsige og kontrollere, hvordan de vil reagere under DEP dem. I dette arbejde, vi specifikt udnyttet lavfrekvente cDEP med MOSE-L-celler til at demonstrere protokollen til bestemmelse af første crossover frekvens af celler, og derefter viste løbende sortering af polystyren perler og MOSE-L-celler baseret på deres modsatrettede DEP svar.
Ændring geometri cDEP enheden vil ændre de rumlige gradienter af det elektriske felt, så enheder at være designet til høj frekvens eller drift ved lave frekvenser, og høj selektivitet og effektivitet af sortering for en bestemt celletype. Derudover kan højkapacitets enheder udvikles ved fremstilling bredere kanaler 30 kanaler i parallel, 30 eller af flerlags fremstilling 35, hvor elektrode kanalerne er vertikalt stablet over og under et relativt dybeprøve kanal. Tynde membraner danner barrieren mellem lagene. Indledende test med enheder fremstillet i polymethylmethacrylat (PMMA) og polykarbonat (PC) tynde film har vist DEP reaktion MOSE-L-celler. Den nuværende indsats i gang for at forfine flere lag high-throughput-enheder og forbedre perifere system i retning af en eventuel plug-and-play-platform. At udvide fra den grundlæggende eksperimentel teknik præsenteret, kan ansøgningerne og specifikationer på enheden være skræddersyet til at passe særlige krav, såsom sortering versus karakterisering eller tilføje prøvebeholdere og en semi-automatiseret system til enheden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes, er blevet støttet delvist af National Science Foundation under Grant No EFRI 0938047, og ved Virginia Tech Institut for kritisk teknologi og Applied Science (ICTAS). Forfatterne vil gerne udtrykke påskønnelse til Dr. Eva Schmelz og Dr. Paul Roberts for deres venlige gave MOSE-L-celler. Forfatterne erkender Angela Anderson for hendes hjælp med cellekultur, Caitlan Swaffar for hendes hjælp med at redigere dette dokument og forberede eksperimenter, og alle Bioelectromechanical Systems lab medlemmer.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2×3 inch-ground edges |
Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll |
Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″ |
D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |