无标记的分离和细胞的富集通过非接触式介电泳

1。制造原型CDEP微流体设备：概述使用光致抗蚀剂和深反应离子蚀刻（DRIE）蚀刻所需的信道设计（ 图1）到硅片（ 图2）按照以前报道的程序22。沉积薄薄的一层聚四氟乙烯的改善的微型装置从晶片上剥离。 图1。低频连续分选装置的示意图，样品通道运行左至右为500μm宽的带锯齿收缩至100μm。两对电极的流体通道构成的源和汇的电极，分别和由20μm厚的PDMS阻挡从样品通道是分开的。 图2。该布标一个CDEP装置ication过程（a）对于60秒，UV光选择性地与光致抗蚀剂通过CDEP设备的几何形状的掩模图案进行曝光（B）光致抗蚀剂是使用显影剂除去。（三）深反应离子蚀刻（DRIE）来蚀刻50微米深的特点，和5分钟的湿法蚀刻以四甲基氢氧化铵（TMAH）的25％，在70℃是用于减少在侧壁上的粗糙度（d）一个特氟隆涂层被添加以改善从设备释放晶片（E）的PDMS倒入可重复使用的晶片邮票脱气后，在100℃F.（F）的PDMS从晶片除去固化45分钟。 PDMS和干净的载玻片暴露于空气等离子处理2分钟，粘合在一起。 用铝箔包装的晶圆，以防止溢出。在10:1至固化剂，脱气约20分钟，比弹性体的混合聚二甲基硅氧烷（PDMS），倒到晶片上。热在100℃下45分钟，以避免损坏邮票的特富龙涂层。让设备冷却下来。 冷却后，除去铝箔，装饰用手术刀片PDMS，并用钝冲床适合于管子的尺寸打孔进入孔在通道的入口/出口。在这里，1.5毫米的钝冲床使用。 用漂洗肥皂和水，乙醇，去离子水，和干燥用的空气，分别清洗的玻璃显微镜载片上。用苏格兰魔术胶带清洁PDMS设备。显微镜下检查，以确保通道是干净的。暴露在滑动和PDMS装置空气等离子体2​​分钟。用力按下设备的通道侧到载玻片上，从而避免形成装置和滑动（ 图3）之间的气泡。 图3。 </st荣>（a）该硅晶片制造邮票，以及（b）与所述样品和填充有分别的绿色和红色食用色素，流体通道电极成品PDMS-玻璃装置中使用的光刻掩模。参见图1尺寸。 点击这里查看大图 。 2。制备细胞悬液中的DEP缓冲制备低导电率（100μS/厘米）的缓冲，这将被称为“介电泳缓冲液”（8.5％蔗糖[重量/体积]，0.3％葡萄糖[重量/体积]，0.725％的RPMI [重量/体积]） 16 暂停细胞中的DEP缓冲器在3×10 6个细胞/ ml。这里，癌晚期小鼠卵巢表面上皮细胞（MOSE-L）细胞的使用。 注：由台盼蓝染色排除法细胞活力分析显示活力略有下降早期MOSE（MOSE-E）的细胞在室温下5小时后，悬浮于DEP缓冲液（由95.1-91.6％）。据预测，在可行性类似轻微下降发生于MOSE-L细胞，表明细胞不应该被存储在缓冲DEP长期。 使用荧光膜渗透性染料，如酶促活化的钙黄绿素AM染细胞。 测量染色的细胞悬浮液的导电性。电导率应约100μS/ cm的。如果电导率测量太高，旋转样品下来，重悬在DEP缓冲器以3×10 6个细胞/ ml，并重复电导率测量。 3。加载CDEP微流控芯片放置在真空下，微流控芯片30分钟。 同时，切下一块的柔性管，以跨越从注射泵的距离，显微镜载物台，其中所述微流体芯片将位于。这里，管道的6英寸长是必需的。飞度油管针尖上的注射器。 通过将目标收集样品体积通过管的横截面面积估计所需的长度为出口管路。切需要管的长度。 绘制细胞悬液注入注射器。检查无气泡存在于管或注射器。 在从真空除去芯片，插入出口管路和素样品通道迅速，以避免被截留的空气气泡在通道。吸，以避免破裂的薄（20微米）时，绝缘壁轻轻拍打注射器，虽然它已经观察到，在阻挡可承受近5毫升/小时的恒定的高通量而不破裂。 以最优惠的电极渠道，快速地将空的枪头在每个电极流体通道的一个出口。吸取200μl的PBS中含有少量罗丹明B和轻轻拍打到流体引入到电极通道的另一端。保持温和的压力直到PBS与罗丹明B明显进步了空的枪头的尖端。重复每个电极通道。罗丹明B仅用于荧光可视化的流体电极通道。 吸后，填充每个枪头储用PBS罗丹明B。避免气泡形成在移液管尖水库，并通过轻轻地上下吹打除去任何可见的气泡。拆下出口管路和适当地丢弃，然后插入一个新的出口管路水库，收集目标卷。 4。使用CDEP芯片细胞的特征分频点定位在倒置显微镜配备有数码相机（ 图4）的阶段的芯片。 图4。 </stroNG>（a）整体实验装置CDEP实验。该CDEP芯片位于倒置显微镜的平台上。一个摄像头的图像发送到计算机进行录制。注射泵保持恒定的入口流。函数发生器产生被加强了由高电压放大器和连接到所述CDEP芯片通过导线电极的信号。示波器监视发送到芯片的信号。（二）CDEP芯片和流体和电子连接的详细视图。 点击这里查看大图 。 安装注射器注射泵和插入线电极插入电极流体通道水库。 通过以1毫升/小时的流体泵，以确保注射泵和注射器之间的良好接触。目视检查沟道长度，以保证细胞的畅通和没有气泡或泄漏。红UCE流量0.005毫升/小时。 注：吞吐量高达100毫升/小时31,35已经在其他几何形状的设备已经实现。 为了安全起见，由开机函数发生器，高压放大器和示波器，并调整到所需的电压和频率测试电子产品。这里这些参数是200 V和20千赫。经核实可接受的性能，关闭电源。电极连接到高电压放大器。 注：在用于这些实验的高电压下工作的电子时，应遵守相应的电气安全规程。 在达到稳流，应用所需的电压在所希望的频率。在该实验中，电压为200伏RMS在5-60千赫之间的频率。 与图像处理技术（步骤5）来量化细胞分布在通道和表征交叉频率的细胞应答的记录的视频文件。要做到这一点，保持一个恒定的电压和系统地改变频率。在该实验中，以及随机实验运行之间的开始和结束时，记录控制单元的分布，该细胞的不施加电场的分布。估计的时间让细胞从入口流到监控位置（此处，5分钟）所需的量。设置一个新的频率后，等待该段时间，然后开始录制（这里是2分钟的视频细胞分布的）。 5。为表征分频点图像处理利用一种计算机脚本，分析每个视频帧由帧来确定相对的y位置（z方向是该信道的垂直深度，y方向是沟道宽度，而x-方向是沟道长度）在每一发荧光的细胞或颗粒的指定的x坐标从在沟道高介电泳力的区域的下游。建立相关显示的图tribution。 在每个电压和频率与所述控制分布的中心线比较分布的中心线。对于给定的电压和频率的变化，确定交叉频率，这里的中心线相匹配的控制的y位置。 6。不同的实验，以进行细胞分选富集或暂停在DEP缓冲器所需的混合物在3×10 6个颗粒/毫升的总浓度。这里，该混合物是MOSE-L细胞中的DEP缓冲器4微米的荧光珠。执行先前描述的步骤，以制备CDEP设备。 从混合物进行排序或富集的细胞，确定了靶细胞的交叉频率和如先前所描述的背景颗粒。操作实验的靶细胞和背景粒子的2分频的频率之间的频率，使得粒子的两个群体经历的DEP力在相反ð从根本上来说。要MOSE-L细胞和4微米微珠进行排序，操作上11.90±0.63 kHz的微型装置。 MOSE-L细胞的第一交叉频率最近报道Salmanzadeh 等人 33 收集的有序样品中的内容，在收集对象的卷取出出口管路，通过将一个手套的手指在所述出口开口并轻轻拉着管。倒入收集目标体积成储以供进一步分析注：其他样品的回收方法可以包括附加的永久贮存到芯片和由简单的移液除去样品。