Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Elizabeth S. Elvington; Alireza Salmanzadeh; Mark A. Stremler; Rafael V. Davalos

doi:10.3791/50634

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Medicina

Contactless dielectrophoresis के माध्यम से लेबल मुक्त अलगाव और कोशिकाओं के संवर्धन

Published: September 03, 2013

doi:

10.3791/50634

Elizabeth S. Elvington, Alireza Salmanzadeh², Mark A. Stremler², Rafael V. Davalos²

¹School of Biomedical Engineering and Science,Virginia Tech, ²Department of Engineering Science and Mechanics,Virginia Tech

Summary

Contactless dielectrophoresis (cDEP) उनके आंतरिक ढांकता हुआ गुण के माध्यम से छंटाई और कणों के संवर्धन को प्राप्त होता है. Fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों बाँझ लक्षण वर्णन गैर हानिकारक और जैविक कणों की छंटाई के लिए cDEP suiting, रवानगी के लिए पारंपरिक धातु इलेक्ट्रोड जगह. हम एक cDEP microdevice तैयार करने और सेल लक्षण वर्णन और छँटाई प्रयोगों का संचालन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

Abstract

Dielectrophoresis (रवानगी) एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र में कणों translational गति से गुजरना polarized जिसके द्वारा घटना है, और एक सतह मार्कर स्वतंत्र ढंग से microparticles की गति निर्देशित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परंपरागत रूप से, रवानगी उपकरणों नमूना चैनल में नमूनों तलीय धातु इलेक्ट्रोड शामिल हैं. इस दृष्टिकोण महंगा हो सकता है और एक विशेष cleanroom वातावरण की आवश्यकता कर सकते हैं. हाल ही में, संपर्क dielectrophoresis (cDEP) नामक एक संपर्क मुक्त दृष्टिकोण विकसित किया गया है. इस विधि प्रत्यक्ष patterning fluidic इलेक्ट्रोड से इलेक्ट्रोड और नमूना के बीच संपर्क और एक भी polydimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट से एक नमूना चैनल से परहेज करते हुए रवानगी की क्लासिक सिद्धांत का इस्तेमाल, और microparticles सॉर्ट और समृद्ध करने के लिए बनाया गया एक तेजी से microfluidic रणनीति के रूप में आवेदन किया है. इस विधि के लिए अद्वितीय बिजली के क्षेत्र से अलग हो रहे हैं जो एक उच्च प्रवाहकीय तरल पदार्थ युक्त fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों के माध्यम से उत्पन्न होता हैएक पतली इन्सुलेट बाधा से नमूना चैनल. धातु इलेक्ट्रोड सीधे नमूना संपर्क नहीं है, इलेक्ट्रोलीज़, इलेक्ट्रोड delamination, और नमूना संदूषण से परहेज कर रहे हैं. साथ ही, यह एक सस्ता और सरल निर्माण की प्रक्रिया में सक्षम बनाता है.

cDEP इस प्रकार संवेदनशील जैविक कणों से छेड़छाड़ के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. कणों पर अभिनय dielectrophoretic बल डिवाइस ज्यामिति का अनुकूलन डिजाइन द्वारा उत्पन्न बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल, लेकिन सेल के आंतरिक biophysical गुणों पर ही नहीं निर्भर करता. जैसे, cDEP अभी bioparticles के लक्षण, संवर्धन, और छँटाई की अनुमति है जबकि फेर से, एक जनसंख्या के भीतर व्यक्त किया जा सकता है कि सतह व्यक्त आणविक बायोमार्कर के आधार पर टाल कि एक लेबल से मुक्त तकनीक है.

यहाँ, हम cDEP का उपयोग निर्माण और प्रयोग की मूल बातें प्रदर्शित करता है. हम नरम लिथोग्राफ का उपयोग कर एक cDEP चिप का सरल तैयारी की व्याख्याY तकनीक. हम एक कण या सेल, dielectrophoretic बल शून्य होता है, जिस पर आवृत्ति के अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निस्र्पक के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर चर्चा की. अंत में, हम डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का एक मिश्रण छँटाई और microspheres (मोती) fluorescing के लिए इस तकनीक के उपयोग के प्रदर्शन.

Introduction

जैविक नमूने संवर्धन और कण छँटाई बाद के विश्लेषण के लिए अक्सर आवश्यक है. ¹ उदाहरण के लिए, शरीर के तरल पदार्थ से दुर्लभ कोशिकाओं के अलगाव के कैंसर का पता लगाने और व्यक्तिगत चिकित्सा में महत्वपूर्ण आवेदन किया है. ^2,3 सबसे अधिक इस्तेमाल संवर्धन तकनीक छँटाई फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल हैं (FACS ) ⁴ और चुंबकीय सक्रिय कक्ष (एमएसीएस), कोशिकाओं को अलग करने के लिए व्यक्त की सतह मार्करों पर भरोसा है, जो ⁵ छँटाई. अन्य रणनीतियों hydrodynamic ⁶ या Inertial ^7,8 छँटाई, ऑप्टिकल चिमटी, ⁹ acoustophoresis, ¹⁰ और dielectrophoresis शामिल हैं. ^11,12 dielectrophoresis एक गैर वर्दी बिजली क्षेत्र की उपस्थिति में एक polarized कण का आंदोलन है. ¹³ रवानगी के लिए इस्तेमाल किया गया है आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला, ^2,14 व्यवहार्यता, ¹⁵ कोशिकाओं के bioelectrical गुण निस्र्पक पर आधारित छँटाई कोशिकाओं सहित, ¹⁶ और क्रमबद्ध करेंकोशिकाओं के biophysical गुणों में परिवर्तन प्रेरित पर आईएनजी. ^17,18 पारंपरिक रवानगी एक वोल्टेज लागू करते हैं और यह एक शक्तिशाली तकनीक है जबकि एक गैर वर्दी बिजली के क्षेत्र. ¹³ प्रेरित करने के लिए एक microfluidic चैनल के भीतर नमूनों तलीय इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल, चुनौतियों जैसे, पैदा कर सकते हैं इलेक्ट्रोड delamination और इलेक्ट्रोलिसिस. इन्सुलेटर आधारित dielectrophoresis (iDEP) ¹⁹ दूषण, इलेक्ट्रोड delamination, और एक डीसी बिजली के क्षेत्र में गैर uniformities प्रेरित कि patterning इन्सुलेट संरचनाओं के माध्यम से इलेक्ट्रोड क्षेत्र के स्थानिक गिरावट की चुनौतियों को संबोधित किया. iDEP चुनिंदा रहते हैं और मृत बैक्टीरिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ¹⁹ बैक्टीरियल बीजाणुओं, ²⁰ और हेरफेर डीएनए, अन्य अनुप्रयोगों के बीच ²¹ अलग. यह अक्सर आवश्यक उच्च डीसी voltages का एक परिणाम के रूप में हो सकता है क्योंकि जौल हीटिंग एक चुनौती हो सकती है. इन चुनौतियों उन्नति, संपर्क मुक्त रवानगी microdevices विकसित किया गया है. ^22-24

<p clasएस = "jove_content"> यहाँ प्रस्तुत तकनीक इतनी धातु इलेक्ट्रोड और नमूना चैनल के बीच सीधे संपर्क की कमी के लिए नामित, contactless dielectrophoresis (cDEP) का इस्तेमाल करता है. इस रणनीति के लिए अद्वितीय ²² से भरा द्रव इलेक्ट्रोड चैनलों के साथ धातु इलेक्ट्रोड के प्रतिस्थापन है एक उच्च प्रवाहकीय समाधान. ये तरल पदार्थ इलेक्ट्रोड capacitively एक एसी वोल्टेज के माध्यम से नमूना चैनल के लिए एक पतली इन्सुलेट बाधा पार मिलकर कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड के साथ नमूना संपर्क को खत्म ऐसी इलेक्ट्रोलिसिस और बुलबुला गठन, नमूना संदूषण, और इलेक्ट्रोड delamination रूप रवानगी आधारित विधियों के साथ जुड़े मुद्दों को कम करता है. यह नमूना में कोशिकाओं की व्यवहार्यता का समर्थन करता है क्योंकि एक परिणाम के रूप में, cDEP जैविक नमूने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. महत्वपूर्ण बात है, cDEP नमूना बाँझपन बनाए रख सकते हैं. एक चिप एक सेल संस्कृति हुड में तैयार किया जा सकता है और प्रयोग धातु इलेक्ट्रोड के लिए नमूना संपर्क की आवश्यकता होती है या नमूना environme के लिए खुला हो कि आवश्यकता के बिना आयोजित किया जा सकता हैNT. एक साधारण जलाशय बाँझ नमूना वसूली की सुविधा के लिए चिप आउटलेट के लिए तय किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, नमूना चैनल के रूप में एक ही biocompatible बहुलक सामग्री (PDMS) से तरल पदार्थ इलेक्ट्रोड का निर्माण धातु इलेक्ट्रोड का रिवाज patterning, निर्माण के लिए आवश्यक समय के साथ खर्च की उच्च लागत कम कर देता है, और प्रारंभिक patterning के लिए विशेष cleanroom उपकरण के लिए की जरूरत की सीमा पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन वेफर स्टाम्प की.

रवानगी की वजह से कणों आंदोलन कण और मध्यम, साथ ही बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल की विशेषताओं पर निर्भर करता है. एक कण और आवृत्ति पर निर्भर कारक, Clausius-Mossotti (मुख्यमंत्री) कारक कहा जाता है, सीमा -0.5 1 करने में कोई मान लेता है, और रवानगी बल की दिशा निर्धारित करता है. मुख्यमंत्री कारक बिल्कुल शून्य है, जिस पर आवृत्ति अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति कहा जाता है. यह कोई dielectrophoretic बल एक कण और मुख्यमंत्री कारक परिवर्तन साइन पर exerted है जो बिंदु है. एक एसनिष्क्रिय ठोस microspheres के लिए चिमनी के पास अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति तब होता है जब नकारात्मक से सकारात्मक मुख्यमंत्री कारक परिवर्तन 0.01 एस / एम, nDEP से pDEP 10 के पास मौजूद है के लिए एक संक्रमण का संकेत पहले अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति के आदेश पर कम चालकता बफर में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए ^25. – 100 kHz, और आकार, आकृति, cytoskeleton, और सेल की झिल्ली गुणों से प्रभावित है. ^26,27 nDEP शासन को pDEP से एक पारी में एक दूसरे अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति 10 मेगाहर्ट्ज के आदेश पर है, और से प्रभावित है नाभिक-cytoplasm अनुपात, कोशिका द्रव्य चालकता, और जालिका. ²⁷ रवानगी बल द्रव का प्रवाह की उपस्थिति के बिना लागू किया जा सकता है, लेकिन यहाँ हम निलंबित कणों की निरंतर छँटाई प्राप्त करने के लिए एक बह तरल पदार्थ का उपयोग. dielectrophoretic बल और स्टोक्स 'खींचें बल के संयुक्त प्रभाव एक कण की translational गति नियंत्रित करती हैं.

हम दो आवृत्ति पर्वतमाला में ऑपरेशन के लिए उपकरणों का विकास किया है. उच्च frequencY उपकरणों (100-600 kHz) ऐसे प्रोस्टेट ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं (tics), murine डिम्बग्रंथि सतह उपकला (मोसे) कोशिकाओं, एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं के रूप में, pDEP और कोशिकाओं का हासिल बैच छँटाई का उपयोग कर संचालित, या THP रहते है चुनिंदा नमूना चैनल में स्थित पदों इन्सुलेट पर ब्याज की कोशिकाओं को फँसाने द्वारा -1 कोशिकाओं. ^28-31 कम आवृत्ति (5-100 kHz) उपकरणों लगातार काम करते हैं, और एक आवृत्ति पर संचालित जब एक जनसंख्या पृष्ठभूमि आबादी अनुभवों जबकि pDEP अनुभव करता है, जिस पर nDEP, छँटाई प्राप्त करने के कण trajectories पुनर्निर्देशित कर सकते हैं. ^32-34 ये कम आवृत्ति उपकरणों, लाल रक्त कोशिकाओं से कैंसर कोशिकाओं को सॉर्ट एक प्रगतिशील मोसे सेल लाइन की ढांकता हुआ गुण में परिवर्तन का निर्धारण, और की गैर प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है आक्रामक मोसे कोशिकाओं के आक्रामक विशेषताओं पीछे पर विषाक्त sphingolipid उपचार. इसके अतिरिक्त, cDEP microdevices वर्तमान अप करने के लिए 1 मिलीग्राम / एच, बढ़ा throughput में संचालित करने के लिए तैयार किया जा सकता हैआर. ^31,35

बताया गया है, लचीलापन और निर्माण की प्रक्रिया की कम लागत प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रक्रिया आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रासंगिक होने की अनुमति जो कस्टम डिजाइन डिवाइस geometries, सक्षम बनाता है. cDEP की लंबी अवधि के लक्ष्य के बाद संस्कृति या प्रसंस्करण के लिए नमूना वसूली के साथ, एक नैदानिक स्तर पर लेबल से मुक्त सेल छँटाई और संवर्धन का एहसास है. यहाँ प्रस्तुत तकनीक रवानगी की पहुंच बढ़ जाती है, जो निर्माण से प्रयोग करने के लिए, एक सरल और सस्ता तरीका है. हम लक्षण वर्णन और फ्लोरोसेंट microspheres से डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के संवर्धन प्राप्त करने के लिए एक cDEP चिप की तैयारी और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. अवलोकन: एक प्रोटोटाइप cDEP microfluidic डिवाइस Fabricating एक सिलिकॉन वेफर में वांछित चैनल डिजाइन (चित्रा 1) (चित्रा 2) खोदना photoresist और दीप प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (DRIE) का उपयोग पहले से सूचना दी प्रक्रियाओं 22 का पालन करें. वेफर से microdevice की रिहाई में सुधार करने के लिए Teflon की एक पतली परत जमा. चित्रा 1. एक कम आवृत्ति निरंतर छँटाई डिवाइस के योजनाबद्ध. नमूना चैनल रन सही करने के लिए छोड़ दिया और 100 माइक्रोन तक sawtooth संकोचनों साथ 500 माइक्रोन चौड़ा है. fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों के दो जोड़े क्रमशः, स्रोत और सिंक इलेक्ट्रोड रचना, और एक 20 माइक्रोन मोटी PDMS बाधा से नमूना चैनल से अलग हो रहे हैं. चित्रा 2. fabrएक cDEP डिवाइस के ication प्रक्रिया. (एक) 60 सेकंड के लिए, पराबैंगनी प्रकाश चुनिंदा cDEP डिवाइस ज्यामिति का एक मुखौटा पैटर्न के माध्यम से उजागर photoresist के साथ प्रतिक्रिया करता है. (ख) Photoresist डेवलपर का उपयोग कर हटा दिया जाता है. (ग) दीप प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (DRIE) 50 माइक्रोन गहरी सुविधाओं खोदना, और 70 डिग्री सेल्सियस पर tetramethylammonium हाइड्रोक्साइड (TMAH) 25% से गीला नक़्क़ाशी के 5 मिनट के लिए किया जाता है ओर दीवारों पर खुरदरापन को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (घ) एक Teflon कोटिंग से युक्ति रिहाई को बेहतर बनाने के लिए जोड़ा है वेफर. (ई) PDMS degassing के बाद फिर से प्रयोग करने योग्य वेफर के टिकट पर डाल दिया है और 100 डिग्री एफ (च) PDMS वेफर से हटा दिया है पर 45 मिनट के लिए ठीक हो जाता है. PDMS और एक साफ ग्लास स्लाइड 2 मिनट के लिए हवा प्लाज्मा के संपर्क में हैं और एक साथ बंधुआ रहे हैं. शलाका पर रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ वेफर लपेटें. लगभग 20 मिनट के लिए एजेंट, de-गैस के इलाज के लिए elastomer के 10:1 अनुपात में polydimethylsiloxane (PDMS) मिक्स, और वेफर पर डालना. गर्मी 100 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए टिकट के Teflon कोटिंग हानिकारक से बचने के लिए. डिवाइस शांत करने की अनुमति दें. ठंडा करने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी को दूर एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग PDMS ट्रिम, और टयूबिंग के आकार के लिए अनुकूल एक कुंद छेदने का उपयोग चैनल इनलेट / आउटलेट पर पहुँच छेद पंच. इधर, एक 1.5 मिमी कुंद शस्र प्रयोग किया जाता है. क्रमश: एक साबुन और पानी से कुल्ला, इथेनॉल, डि पानी, और हवा के साथ सुखाने, का उपयोग कर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड साफ करें. स्कॉच जादू टेप का उपयोग PDMS डिवाइस से साफ करें. चैनलों साफ कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने की खुर्दबीन के नीचे की जांच करना. 2 मिनट के लिए हवा प्लाज्मा के लिए स्लाइड और PDMS डिवाइस बेनकाब. मजबूती डिवाइस और स्लाइड (चित्रा 3) के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचने, गिलास स्लाइड के लिए इस उपकरण का चैनल की ओर दबाएं. चित्रा 3. </stरोंग> (एक) सिलिकॉन वेफर स्टाम्प निर्माण, और नमूना और क्रमश: हरे और लाल रंग भोजन से भरा द्रव इलेक्ट्रोड चैनलों के साथ (ख) समाप्त PDMS गिलास डिवाइस दौरान फोटोलिथोग्राफी के लिए इस्तेमाल मुखौटा. आयामों के लिए चित्रा 1 देखें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . 2. रवानगी बफर में एक सेल निलंबन की तैयारी "रवानगी बफर" के रूप में संदर्भित किया जाएगा जो एक कम चालकता तैयार (100 μS / सेमी) बफर, (8.5% sucrose [डब्ल्यू / वी], 0.3% ग्लूकोज [डब्ल्यू / वी], 0.725% RPMI [डब्ल्यू / V]) . 16 3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल रवानगी बफर में कोशिकाओं को निलंबित. इधर, कैंसर देर चरण माउस डिम्बग्रंथि सतह उपकला (मोसे-एल) कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं. नोट: trypan नीले डाई अपवर्जन विधि द्वारा सेल व्यवहार्यता विश्लेषण व्यवहार्यता में मामूली कमी देखी गई5 घंटा बाद कमरे के तापमान पर रवानगी बफर में निलंबित प्रारंभिक अवस्था मोसे (मोसे ई) कोशिकाओं की (95.1-91.6% से). यह व्यवहार्यता में एक ऐसी ही मामूली कमी कोशिकाओं लंबे समय तक बफर रवानगी में संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए कि यह दर्शाता है, मोसे एल कोशिकाओं के लिए होता है कि भविष्यवाणी की है. ऐसे enzymatically सक्रिय calcein AM रूप में, एक फ्लोरोसेंट झिल्ली पारगम्य डाई का उपयोग कोशिकाओं डाई. रंगे सेल निलंबन की चालकता उपाय. चालकता लगभग 100 μS / सेमी होना चाहिए. चालकता माप बहुत अधिक है, 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स 10 3 पर रवानगी बफर में, नीचे resuspend नमूना स्पिन और चालकता माप दोहराएँ. 3. CDEP microfluidic चिप लोड हो रहा है 30 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत microfluidic चिप रखें. इस बीच, microfluidic चिप स्थित हो जाएगा जहां खुर्दबीन चरण के लिए सिरिंज पंप से दूरी अवधि के लिए लचीला टयूबिंग की एक टुकड़ा काट. इधर, टयूबिंग की एक 6 इंच लंबाईआवश्यक है. सिरिंज पर टिप सुई करने के लिए फ़िट ट्यूबिंग. ट्यूब के पार के अनुभागीय क्षेत्र से लक्ष्य एकत्र नमूना मात्रा विभाजित करके आउटलेट टयूबिंग के लिए आवश्यक लंबाई का अनुमान है. टयूबिंग की लंबाई की आवश्यकता काटें. सिरिंज में सेल निलंबन ड्रा. कोई बुलबुले ट्यूबिंग या सिरिंज में स्थित हैं कि जाँच करें. वैक्यूम से चिप को हटाने पर, चैनलों में फंस हवाई बुलबुले से बचने के लिए जल्दी आउटलेट टयूबिंग और प्रधानमंत्री नमूना चैनल डालें. बाधा इन्सुलेट पतली (20 माइक्रोन) rupturing से बचने के लिए भड़काना जब यह बाधा rupturing के बिना 5 एमएल / घंटा के पास एक निरंतर उच्च throughput सामना कर सकते देखा गया है कि हालांकि धीरे, सिरिंज टैप करें. प्रधानमंत्री इलेक्ट्रोड चैनलों के लिए, जल्दी से प्रत्येक fluidic इलेक्ट्रोड चैनल के एक आउटलेट में खाली पिपेट सुझावों जगह है. Rhodamine बी की एक छोटी राशि युक्त पीबीएस के 200 μl पिपेट और धीरे इलेक्ट्रोड चैनल के विपरीत अंत में तरल पदार्थ पेश करने का दोहन. कोमल दबाव बनाए रखेंrhodamine बी के साथ पीबीएस दिख खाली पिपेट टिप टिप ऊपर की प्रगति जब तक. प्रत्येक इलेक्ट्रोड चैनल के लिए दोहराएँ. Rhodamine बी केवल fluorescently fluidic इलेक्ट्रोड चैनलों कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. भड़काना के बाद, पिपेट टिप जलाशयों में rhodamine बी से बचें बुलबुला गठन के साथ पीबीएस के साथ प्रत्येक पिपेट टिप जलाशय को भरने, और ऊपर और नीचे धीरे pipetting द्वारा किसी भी दृश्य बुलबुला हटा दें. आउटलेट टयूबिंग को अलग करें और उचित त्यागें, तो लक्ष्य मात्रा एकत्र करने के लिए एक ताजा आउटलेट टयूबिंग जलाशय डालें. 4. CDEP चिप का उपयोग कोशिकाओं की निस्र्पक अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति डिजिटल कैमरा (चित्रा 4) के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर चिप स्थिति. चित्रा 4. </stroएनजी> (क) cDEP प्रयोगों के लिए समग्र प्रयोगात्मक सेटअप. cDEP चिप उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर स्थित है. एक कैमरा रिकॉर्डिंग के लिए कंप्यूटर के लिए छवियों को भेजता है. सिरिंज पंप एक निरंतर इनलेट प्रवाह को बनाए रखता है. समारोह जनरेटर उच्च वोल्टेज एम्पलीफायर द्वारा कदम रखा और तार इलेक्ट्रोड से cDEP चिप से जुड़ा है, जो एक संकेत उत्पन्न करता है. आस्टसीलस्कप चिप के लिए भेजा संकेत नज़र रखता है. (ख) cDEP चिप और fluidic और इलेक्ट्रॉनिक कनेक्शन की विस्तार से देखें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . सिरिंज पंप पर सिरिंज माउंट और fluidic इलेक्ट्रोड चैनल जलाशयों में तार इलेक्ट्रोड डालें. सिरिंज पंप और सिरिंज के बीच अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने के लिए 1 मिलीग्राम / घंटा पर के माध्यम से द्रव पम्प. दिखने में बेरोक कोशिकाओं के प्रवाह और बुलबुले या लीक की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए चैनल लंबाई का निरीक्षण किया. लाल0.005 मिलीग्राम / घंटा तक UCE प्रवाह की दर. नोट: 1 मिलीलीटर / घंटा 31,35 के रूप में के रूप में उच्च throughput अन्य geometries के उपकरणों में हासिल किया गया है. सुरक्षा के लिए, समारोह जनरेटर, उच्च वोल्टेज एम्पलीफायर, और आस्टसीलस्कप पर शक्ति, और वांछित वोल्टेज और आवृत्ति को समायोजित करके इलेक्ट्रॉनिक्स परीक्षण. यहाँ इन मापदंडों 200 वी और 20 kHz हैं. स्वीकार्य प्रदर्शन, बिजली बंद के सत्यापन पर. उच्च वोल्टेज एम्पलीफायर के लिए इलेक्ट्रोड से कनेक्ट करें. नोट: इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल उच्च वोल्टेज में इलेक्ट्रॉनिक्स जब ऑपरेटिंग उपयुक्त विद्युत सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन. सतत प्रवाह प्राप्त करने पर, इच्छित आवृत्ति में वांछित वोल्टेज लागू होते हैं. इस प्रयोग में, वोल्टेज 5-60 kHz के बीच आवृत्तियों पर 200 वी आरएमएस है. इमेज प्रोसेसिंग तकनीक चैनल में सेल वितरण यों के लिए और अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति को चिह्नित करने के लिए (5 कदम) के साथ सेल प्रतिक्रिया का रिकॉर्ड वीडियो फ़ाइलों. ऐसा करने के लिएएक निरंतर वोल्टेज बनाए रखने और व्यवस्थित आवृत्ति बदलती हैं. प्रयोग है, साथ ही बेतरतीब ढंग से प्रयोगात्मक रन के बीच के शुरू और अंत में, किसी भी बिजली के क्षेत्र लागू करने के बिना कोशिकाओं के वितरण पर नियंत्रण सेल वितरण रिकॉर्ड. कोशिकाओं (यहाँ, 5 मिनट) पर नजर रखी स्थान पर प्रवेश से प्रवाह करने के लिए आवश्यक समय की राशि का अनुमान. एक नई आवृत्ति निर्धारित करने के बाद, फिर (, यहां सेल वितरण का एक 2 मिनट वीडियो) की रिकॉर्डिंग शुरू, समय की इस राशि के इंतजार. 5. निस्र्पक अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति के लिए इमेज प्रोसेसिंग एक कम्प्यूटेशनल स्क्रिप्ट का प्रयोग, रिश्तेदार Y-स्थिति (z-दिशा चैनल के ऊर्ध्वाधर गहराई है जहां, वाई दिशा चैनल चौड़ाई है, और एक्स दिशा चैनल लंबाई है) निर्धारित करने के लिए फ्रेम से प्रत्येक वीडियो फ्रेम का विश्लेषण पर प्रत्येक fluorescing सेल या कण का एक बहाव चैनल में उच्च रवानगी बल के क्षेत्र से X-निर्देशांक निर्दिष्ट. सापेक्ष जिले का ग्राफ बनाएँयोगदान. नियंत्रण वितरण के centerline के साथ प्रत्येक वोल्टेज और आवृत्ति पर वितरण के centerline तुलना कर लें. एक दिया वोल्टेज और अलग आवृत्तियों के लिए, centerline नियंत्रण की Y-स्थिति से मेल खाता है, जहां अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति, निर्धारित करते हैं. 6. सेल छँटाई या संवर्धन प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग परिवर्तनीय 3 एक्स 10 6 कणों / मिलीलीटर की कुल एकाग्रता पर रवानगी बफर में वांछित मिश्रण निलंबित. इधर, इस मिश्रण रवानगी बफर में 4 माइक्रोन fluorescing मोतियों के साथ मोसे एल कोशिकाओं है. एक cDEP डिवाइस तैयार करने के लिए पहले से वर्णित चरणों को पूरा करें. एक मिश्रण से कोशिकाओं को सॉर्ट या समृद्ध है, लक्ष्य कोशिकाओं के विदेशी आवृत्तियों और के रूप में पहले वर्णित पृष्ठभूमि कणों का निर्धारण. कणों की दो आबादी विपरीत डी में रवानगी बलों का अनुभव इतना है कि लक्ष्य की कोशिकाओं और पृष्ठभूमि कणों की दो विदेशी आवृत्तियों के बीच एक आवृत्ति पर प्रयोग प्रचालनirections. मोसे एल कोशिकाओं और 4 माइक्रोन मोती सॉर्ट करने के लिए, 11.90 ± 0.63 kHz ऊपर microdevice कार्य करते हैं. हाल ही में Salmanzadeh एट अल. 33 द्वारा रिपोर्ट मोसे एल कोशिकाओं की पहली क्रॉसओवर आवृत्ति एक हल नमूना की सामग्री इकट्ठा करने के लिए, आउटलेट खोलने पर एक दस्ताना उंगली रखने और धीरे ट्यूबिंग पर tugging द्वारा, लक्ष्य मात्रा एकत्रित होने पर आउटलेट टयूबिंग निकालें. आगे के विश्लेषण के लिए एक जलाशय में एकत्र लक्ष्य मात्रा डालो नोट:. अन्य नमूना वसूली तरीकों चिप के लिए एक स्थायी जलाशय संलग्न और सरल pipetting द्वारा नमूना हटाने शामिल हो सकते हैं.

Representative Results

रवानगी बिजली के क्षेत्र मौजूद है जब डिवाइस कार्य कर रही है इसकी पुष्टि के लिए नमूना चैनल में गुणात्मक मनाया जाना चाहिए. रवानगी की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए एक विधि दूर मजबूत pDEP और nDEP भविष्यवाणी कर रहे हैं, जहां अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति pDEP और एक में सबसे अधिक स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं के लिए nDEP निरीक्षण करने के लिए <10 kHz निरीक्षण करने के लिए (लगभग> 40 kHz से मूल्यों को आवृत्ति समायोजित करने के लिए है ) 100 μS / सेमी की चालकता के साथ बफर. यह निष्क्रिय microspheres उनके अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति ऊपर अपने अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति नीचे pDEP प्रदर्शन और nDEP कि ध्यान दिया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत sawtooth सुविधा ज्यामिति के लिए, pDEP कम परीक्षण आवृत्ति पर है, जबकि nDEP, मोती श्रृंखलन और चैनल के sawtooth सुविधा किनारे पर कोशिकाओं या कणों का ध्यान केंद्रित की घटना ने संकेत दिया, उच्च परीक्षण आवृत्ति पर कोशिकाओं के लिए देखा जाना चाहिए कोशिकाओं चैनल के सीधे बढ़त नजदीक क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं के रूप में स्पष्ट होना चाहिए. इन कम आवृत्तियों पर, कोशिकाओं LYS सकता हैकारण electroporation के लिए ई, इसलिए नमूना कम सेल होते दिखाई दे सकते हैं, और एक enzymatically सक्रिय fluorescing डाई का उपयोग अगर दिखाई दे रहे हैं कि उन बढ़े या धुँधली दिखाई दे सकते हैं. PDEP और nDEP होते हैं, जिस पर आवृत्तियों का सत्यापन करना प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति के निर्धारण की अनुमति देता है. यहां इस्तेमाल ऐसी मोसे एल के रूप में स्तनधारी कैंसर की कोशिकाओं, के लिए, हम 60 kHz (चित्रा 5 ब) में 5 kHz (चित्रा 5A) और मजबूत pDEP पर nDEP मनाया. मोसे एल कोशिकाओं 17.7 ± 3.3 माइक्रोन (एन = 268 कोशिकाओं) की एक व्यास था और मोती 4 माइक्रोन नाममात्र व्यास है. प्रगति के पहले चरण में मोसे कोशिकाओं की तुलना में मोसे एल कोशिकाओं की ढांकता हुआ गुण का एक पूरा विश्लेषण Salmanzadeh एट अल. 33 द्वारा हाल ही में काम में पाया जा सकता है PDEP और nDEP इन चरम पर मनाया नहीं कर रहे हैं, विभिन्न समस्याओं उत्पन्न हो सकता है. नमूना चालकता कारण contaminants या सेल lysing को बहुत अधिक हो सकती है. InsufficieNT बिजली के क्षेत्र की वजह से नमूना चैनल से सटे चैनलों के भाग के लिए वर्तमान के चालन को रोकने के जो द्रव इलेक्ट्रोड चैनलों में फंस बुलबुले को उत्पन्न किया जा सकता है. अस्थिर प्रवाह एक पर्याप्त समय के लिए वैक्यूम के अंतर्गत डिवाइस नहीं रख या जल्दी होने के कारण खराब बंधुआ PDMS की delamination को वैक्यूम, रिसाव से हटाने पर डिवाइस नहीं भरने से उत्पन्न बुलबुले, सिरिंज या इनलेट ट्यूबिंग में फंसे एक बुलबुला की वजह से हो सकता है पंप परिचालन सीमा के चरम पर चैनलों को भरने, या प्रवाह की दर जब गिलास स्लाइड की वजह से अत्यधिक बल के लिए बाधा झिल्ली में आँसू डाला. कोशिकाओं के अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निर्धारित करने के अलावा, इस तकनीक मोसे एल कोशिकाओं और मोतियों का एक मिश्रण द्वारा यहाँ सचित्र एक मिश्रण, सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण मोसे एल कोशिकाओं सकारात्मक dielectrophoresis (pDEP) का अनुभव जहां आवृत्तियों पर 4 माइक्रोन मोती द्वारा प्रदर्शित नकारात्मक dielectrophoresis (nDEP) का लाभ लेता है. हम ओ200 वी आरएमएस और 10 kHz (6a चित्रा) पर डिवाइस perated और वे nDEP अनुभवी के रूप में कोशिकाओं और मोती दोनों मिलाया गया कि मनाया. मोती दो घटकों (चित्रा 6B) में मिश्रण की जुदाई को सक्षम करने, चैनल के निचले हिस्से तक ही सीमित थे, जबकि 50 kHz पर हम चैनल के शीर्ष पर मोसे एल कोशिकाओं के आंदोलन को मनाया. चित्रा 5. मोसे एल कोशिकाओं की स्थिति आवेदन बिजली क्षेत्र की आवृत्ति बदलने से छेड़छाड़ है. तस्वीरें नमूना चैनल में अंतिम sawtooth सुविधा पर लिया जाता है और fluidic इलेक्ट्रोड सही पक्ष पर कोनों में स्थित हैं. वे पीबीएस चैनल कल्पना करने fluoresces जो rhodamine बी, जिसमें से भर रहे हैं. (एक) मोसे एल कोशिकाओं 200 वी आरएमएस में nDEP अनुभव और 5 kHz. (ख) मोसे एल कोशिकाओं 200 वी आरएमएस और 60 kHz पर मोती श्रृंखलन और pDEP अनुभव. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 6. मोसे एल कोशिकाओं (हरा) और 4 माइक्रोन मोती (लाल) के एक मिश्रण 200 वी पर (एक). एक कम आवृत्ति cDEP डिवाइस का नमूना चैनल में अंतिम sawtooth सुविधा के माध्यम से प्रवाह और 10 kHz कोशिकाओं और मोती मिश्रित कर रहे हैं. तीर 200 वी पर (ख). थोड़े बल की संभावना की वजह से कम आवृत्ति शर्तों को मृत्यु हो गई है कि कोशिकाओं में दिखने के लिए बिंदु और 50 kHz कोशिकाओं pDEP अनुभव और चैनल की सुविधा किनारे करने के लिए कदम, मोती nDEP का अनुभव करते हुए और इस क्षेत्र के नजदीक तक ही सीमित रहते हैं सीधे धार.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

रवानगी कणों की ढांकता हुआ गुण का निर्धारण और, अलगाव, या संवर्धन अनुप्रयोगों छँटाई के प्रति कण गति निर्देशन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. कारण एक नमूना के साथ सीधे इलेक्ट्रोड संपर्क के हानिकारक प्रभाव को, दूसरों के संपर्क से बचने के लिए पहले से प्रस्तुत विधि के समान दृष्टिकोण ले लिया है. उदाहरण के लिए, बशीर एट अल. एक पतली गिलास coverslip द्वारा मुद्रित सर्किट बोर्ड इलेक्ट्रोड से अलग एक microfluidic PDMS डिवाइस का उपयोग करके संपर्क मुक्त रवानगी उपकरणों का विकास किया है, और इस तकनीक को भी वीडियो प्रारूप में उपलब्ध कराया गया है. ^23,36

यहाँ, हम एक एकल PDMS सब्सट्रेट का उपयोग एक cDEP चिप और fluidic इलेक्ट्रोड का निर्माण, और कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट मोती का एक मिश्रण से डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पता चला है. प्रस्तुत तकनीक को सफलतापूर्वक लिव छँटाई सहित अधिक जटिल और physiologically प्रासंगिक अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया गया हैई और मृत कोशिकाओं, ²⁸ ट्यूमर प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं से कोशिकाओं की शुरुआत कमजोर लाल रक्त कोशिकाओं, ^31,32 और स्तन कैंसर के ³⁷ और डिम्बग्रंथि के कैंसर के चरणों के बीच फर्क से ³⁰ कैंसर कोशिकाओं. ²⁹ cDEP भी कणों के मिश्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है. ³⁸ इन आवेदन पत्र प्रस्तुत सरल तकनीक का उपयोग करके, विविध उद्देश्यों चैनल ज्यामिति का डिजाइन बदलकर बस पूरा किया जा सकता है.

. रवानगी कणों गोलाकार कण के लिए ¹³ के हेरफेर के लिए microscale पर उपयोगी है, translational dielectrophoretic बल आकार और बिजली के कण और इसकी निलंबित माध्यम के गुण, साथ ही बिजली क्षेत्र की ढाल चुकता पर निर्भर करता है:

ε _एम निलंबित मध्यम के permittivity है जहां, आर त्रिज्या हैकण की, और आर सी [कश्मीर (ω)] Clausius-Mossotti (मुख्यमंत्री) कारक के असली हिस्सा है. मुख्यमंत्री कारक निलंबित मध्यम की तुलना में कण के रिश्तेदार polarizability का एक उपाय है और dielectrophoretic बल की दिशा निर्धारित करता है. यह रूप में वर्णित है

जहां और क्रमशः कण और मध्यम, के जटिल permittivities हैं. जटिल permittivity, , चालकता (σ) और आवृत्ति (ω) पर निर्भर करता है. गोलाकार कणों की मुख्यमंत्री कारक सैद्धांतिक रूप -0.5 और 1 के बीच ही है. मुख्यमंत्री कारक नकारात्मक है, तो मध्यम कण से भी अधिक polarizable है, तो कणों क्षेत्रों की से दूर ले जाते हैं, क्योंकि कणों nDEP अनुभवउच्च बिजली के क्षेत्र ढ़ाल. मुख्यमंत्री कारक सकारात्मक है, तो कणों मध्यम से अधिक polarizable हैं और वे उच्च बिजली के क्षेत्र ढ़ाल के क्षेत्रों की ओर कदम जिसमें pDEP अनुभव.

ऐसी कोशिकाओं के रूप में संरचना में nonhomogeneous हैं कि जैविक कणों के लिए, Clausius-Mossotti कारक कण permittivity के लिए एक प्रभावी मूल्य से निर्धारित किया जा सकता है:

जहां और क्रमशः ऐसी कोशिका द्रव्य के रूप में सेल के इंटीरियर,, और प्लाज्मा झिल्ली, के प्रभावी जटिल permittivity की जटिल permittivity हैं;. आर सेल की त्रिज्या है, और डी प्लाज्मा झिल्ली की मोटाई है ²⁶

रवानगी एक में निलंबित कणों के साथ होता हैतरल पदार्थ, तरल पदार्थ के कण रिश्तेदार की गति कण पर एक खींचें बल उत्पन्न होगा. कण पर अभिनय समग्र बल निर्धारित करते समय इस खींचें बल पर विचार किया जाना चाहिए. यहाँ ब्याज की स्थितियों के लिए, चिपचिपा बलों पर हावी है और कण, गोलाकार छोटे, और अपेक्षाकृत कम वेग से चल ग्रहण कर रहे हैं, तो 'स्टोक्स खींचें कानून खींचें बल के लिए एक अच्छा सन्निकटन प्रदान करता है:

η तरल पदार्थ का चिपचिपापन है जहां, यू _पी कण का वेग है, और यू _एफ भी चलती हो सकता है जो तरल पदार्थ के वेग है. Dielectrophoretic बल, तरल पदार्थ और कण गुण जाना जाता है, और एक ज्ञात प्रवाह वेग को देखते हुए, खींचें बल और dielectrophoretic बल के बीच संतुलन कण वेग आकलन करने के लिए हल किया जा सकता है. कोशिकाओं अनुभव सीमा से नीचे होना चाहिए कि कतरनी दर जो सी मेंपक्ष lysing हो सकता है.

कणों की बिजली के गुणों की विशेषता भविष्यवाणी और वे रवानगी के तहत उन्हें कैसे प्रतिक्रिया करेगा नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है. इस काम में, हम विशेष रूप से कोशिकाओं की पहली अंतरराष्ट्रीय आवृत्ति निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए मोसे एल कोशिकाओं के साथ कम आवृत्ति cDEP उपयोग किया है, और फिर उनके विरोध रवानगी प्रतिक्रियाओं पर आधारित polystyrene मोती और मोसे एल कोशिकाओं की निरंतर छँटाई दिखाया.

CDEP डिवाइस की ज्यामिति उपकरणों उच्च आवृत्ति या कम आवृत्ति आपरेशन के लिए तैयार करने की अनुमति, बिजली क्षेत्र के स्थानिक ढ़ाल बदलने के लिए, और उच्च चयनात्मकता और एक निर्दिष्ट सेल प्रकार के लिए छँटाई की दक्षता के लिए होगा फेरबदल. साथ ही, उच्च throughput उपकरणों व्यापक चैनलों fabricating द्वारा विकसित किया जा सकता है, समानांतर, ³⁰ में या इलेक्ट्रोड चैनलों खड़ी एक अपेक्षाकृत गहरे ऊपर और नीचे खड़ी दिखती हैं जिसमें बहुपरत निर्माण ^{35, 30} चैनलोंनमूना चैनल. पतली झिल्ली परतों के बीच अवरोध के रूप में. Polymethylmethacrylate (PMMA) और पॉली कार्बोनेट में गढ़े उपकरणों के साथ प्रारंभिक परीक्षण (पीसी) पतली फिल्मों मोसे एल कोशिकाओं की रवानगी प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है. वर्तमान प्रयासों बहु परत उच्च throughput उपकरणों को निखारने के लिए और एक अंतिम प्लग और खेलने के मंच की ओर परिधीय प्रणाली में सुधार के लिए चल रहे हैं. प्रस्तुत बुनियादी प्रयोगात्मक तकनीक से विस्तार करने के लिए, डिवाइस के अनुप्रयोगों और विशिष्टताओं को इस तरह के लक्षण वर्णन बनाम छँटाई, या उपकरण के लिए नमूना जलाशयों और एक अर्द्ध स्वचालित प्रणाली को जोड़ने के रूप में विशेष मांग है, फिट अनुरूप किया जा सकता है.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

समर्थित यह काम राष्ट्रीय विज्ञान अनुदान सं EFRI 0938047 के तहत फाउंडेशन, और क्रिटिकल प्रौद्योगिकी और एप्लाइड साइंस के लिए वर्जीनिया टेक संस्थान द्वारा (ICTAS) द्वारा भाग में समर्थित किया गया है. लेखकों मोसे एल कोशिकाओं के अपने तरह का उपहार के लिए डॉ. ईवा Schmelz और डॉ. पॉल रॉबर्ट्स को प्रशंसा व्यक्त करना चाहते हैं. लेखकों उसे इस दस्तावेज़ को संपादित करने और प्रयोगों की तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए सेल संस्कृति, Caitlan Swaffar साथ सहायता, और सभी Bioelectromechanical सिस्टम लैब के सदस्यों के लिए एंजेला एंडरसन को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI,USA	Sylgard 184
Glass slides	The Microscope Depot	76079	2×3 inch-ground edges
Microbore PTFE Tubing	Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA	EW-06417-31	Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll
Luer-slip plastic syringes	National Scientific company	S7510-1
Needle tip	Howard Electronic instruments	JG20-1.0	20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″
D(+)-Sucrose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S3-500
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous	Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ	AC410955000
RPMI-1640 Medium	Quality Biological Inc.	112-025-101
Calcein AM, Molecular Probes	Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA	C3100MP	excitation wavelength 488/emission wavelength 516
Rhodamine B, O	Science Lab	SLR1465-100G	excitation wavelength 540/emission wavelength 625
Phosphate buffered saline (10X)	Gbiosciences, St. Louis, MO	RC-147
Leica, inverted light microscope	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DMI 6000B
Leica DFC420, color camera	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	Leica DFC420
Function generator	GW Instek, Taipei, Taiwan	GFG-3015
Wideband power amplifier	Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA	AL-50HF-A
HFHV Output Transformer		AL-T50-V25/300-F100K-600K
High voltage amplifier	Trek	Model 2205
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz	AgilentTechnologies	U2701A
Expanded Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001/002 (115/230V)	air plasma
Scotch Magic tape	3M		any available width is sufficient
1.5 mm puncher	Harris Uni-Core	Z708836-25EA
.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
FluoSpheres Sulfate Microspheres	Invitrogen	F8858	4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)
AZ 9260 photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K developer	AZ Electronic Materials
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%			provided by Virginia Tech cleanroom
Teflon coating			applied using DRIE machine
Silicon wafer	University Wafer	452	100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP)
Deep Reactive Ion Etching (DRIE)	Alcatrel	AMS SDE 100

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Elvington, E. S., Salmanzadeh, A., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis. J. Vis. Exp. (79), e50634, doi:10.3791/50634 (2013).