腺病毒转导朴素的CD4 T细胞调节性T细胞分化研究

调节性T细胞是维持免疫耐受，抑制过度的免疫反应的关键。调节性T细胞抑制T细胞活化的旁观者。因此，调节性T细胞的消融导致致命的自身免疫和自我毁灭的驱动由活化的T细胞^1。调节性T细胞在胸腺中发展CD4单阳性前体的阴性选择过程中，但他们也可以从幼稚后，低剂量的抗原刺激的CD4 + T细胞具有次优的协同刺激^1,2分化的周围。胸腺调节性T细胞似乎抑制组织对自身抗原的自身免疫性疾病，而周边有牵连的调节性T细胞在肠道或肺部提供宽容。这些诱导Tregs的有效阻止T细胞活化后在粘膜外来抗原的识别，包括环境抗原的食物和空气，共生细菌，过敏原^3,4。此外，调节性T细胞是关键，建立孕产妇胎儿肽的耐受性^和预先发泄移植物抗宿主病^。与此同时，调节性T细胞介导不良影响肿瘤细胞的免疫监视^7,8衰减。调节性T细胞的共同特征，是指定的子集转录因子Foxp3，叉头域的转录因子，是必要的，足以赋予Treg细胞功能^9,10的表达。一些信号转导通路，可诱导Foxp3的表达是众所周知的。然而，分子的过程控制，调节，或调节调节性T细胞分化的T细胞受体触发的了解较少。

调节性T细胞可以非常有效地在体外诱导幼稚的CD4 + T细胞与抗-CD3和抗CD28抗体的存在下，TGF-β和IL-2 ¹¹通过刺激。由于新兴的调节性T细胞在体内的功能，促进调节性T细胞分化的分子操纵承担巨大的潜力，未来的therapi上课，例如，治疗哮喘，克罗恩病，移植^11,12。相反，治疗调制阻止Treg细胞分化的分子可能在未来的肿瘤患者的综合治疗方法中受益。

一直在体外诱导分化实验的描述都与T细胞亚群分化的分子变化。在此刻，实验尝试搜索或基因产物的屏幕控制T细胞分化异位基因表达的最常用的方法失败，在幼稚T细胞的事实而受到阻碍。例如，电穿孔，逆转录病毒转导是唯一有效的活化的T细胞中。与此相反的最初预期的慢病毒转导，这是通常在静息细胞中有效，需要预活化幼稚T细胞的细胞因子是^13。此外，在电穿孔过程中的cDNA或mRNA的转移涉及质膜的去极化，其本身赋予T细胞活化的功能，甚至可能动员的Ca ^{2 +}信号 并且激活NFAT蛋白（未发表的观察和参考文献^14）。类似地，对于逆转录病毒转导，幼稚T细胞被激活为18 – 40小时。在这段时间内，在细胞分裂过程中，核膜破裂的发生，并允许为随后的基因组整合的逆转录病毒载体^15。因此，这些方法是不能够解决早期的分子调控初始T细胞与抗原相遇，这是辅助性T细胞分化的决定性阶段。

腺病毒转导是已知的，赋予短暂异位基因表达的人类细胞类型中表达的人柯萨奇腺病毒受体（CAR）的一些。进行没有要求细胞活化或细胞周期进程。表面表达的CAR是必不可少的有效的病毒附件和内在，发现转基因表达的截断版本CARΔ1的T细胞特异性启动子下使小鼠胸腺细胞和T细胞受到腺病毒感染^16。重要的是，转基因不改变胸腺细胞发育或在体外分化幼稚的CD4 T细胞分成不同的子集（数据未显示;文献^17）。以前使用的腺病毒介导的转导T细胞过表达^17,18和击倒方法^19,20。的转基因T细胞可被纯化从市售的DO11.10的TG;：CARΔ1的TG（Taconic公司，Inc。和参考文献^17）。重要的是，腺病毒转导允许在幼稚T细胞中感兴趣的基因的高表达而诱导激活的明显迹象。 T细胞保持天真（CD44 ^低 ，CD62L ^高 ），休息（CD25 ^– ，CD69 ^{– ）}后infecti和可以被激活和调节性T细胞分化成类似的非感染的细胞。

腺病毒介导的生产可以实现HEK293A细胞转染后，腺病毒载体（图1）。这些质粒通常含有E1和E3基因删除，以使重组病毒无法复制的²¹人5型腺病毒基因组。 HEK293A细胞补充不足，因为他们已经通过稳定整合剪切腺病毒²²永生复制。由于腺病毒载体是大的（〜40 kb的），因此不适合于传统的限制性内切酶介导的克隆，我们采用的网关系统。感兴趣的基因的最初克隆到一个较小的输入矢量，从它可以很容易地转移到腺病毒的目标向量通过拉姆达重组反应^{（LR）23。}我们构建了pCAGAdDu载体相结合的的CAG启动（鸡肌动蛋白启动子和CMV增强）的表达盒含有LR网站侧翼原核CCDB选择标记^24。此表达盒的一个内部核糖体进入位点（IRES）元件，允许共表达真核感染标记增强型绿色荧光蛋白（EGFP），这是含有牛生长激素多聚（A）信号序列融合到融合。我们选择的CAG顺式调控序列，由于原型的CMV启动子被认为是高度活化相关的，因此不利于在幼稚T细胞的基因表达。

在这里，我们提供了一个协议，用于高效在体外调节性T细胞的分化和幼稚的CD4 T细胞转导方法，无需激活（图2）。该方法使异位基因表达或击倒前面的CD4 T细胞分化的幼稚状态。它允许测试一个overexpresse的效果d基因的兴趣在早期信号事件在初始TCR刺激，直到T细胞亚群的承诺。我们的验证实验也提供了基础，建立类似的腺病毒应用程序在其他T细胞亚群，如Th1细胞和Th2，TH9，Th17细胞，TH22，或TFH细胞的分化。