Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l'attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l'ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate ^1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione ^1,2. Timica Treg sembra sopprimere l'autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati implicati nel fornire tolleranza nell'intestino o polmonari. Questi indotta Treg potentemente prevenire l'attivazione delle cellule T dopo il riconoscimento di antigeni estranei nella mucosa, tra antigeni ambientali da cibo e aria, batteri commensali, e allergeni ^3,4. Inoltre, Tregs sono cruciali per stabilire la tolleranza materna al peptidi fetali ⁵ e quello di prevent malattia del trapianto contro l'ospite ^6. Allo stesso tempo, Tregs anche mediare effetti indesiderati attenuando sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali ^7,8. L'elemento caratterizzante Tregs è l'espressione del sottoinsieme specificando-fattore di trascrizione Foxp3, un fattore di trascrizione dominio contenente forcella-testa che è necessario e sufficiente per conferire funzione ^9,10 Treg. Alcune vie di segnalazione che possono indurre l'espressione Foxp3 sono noti. Tuttavia, i processi molecolari che controllano, regolano o modulano Treg differenziazione in risposta al recettore delle cellule T innescando sono meno conosciuti.

Tregs molto efficace può essere indotta in vitro mediante la stimolazione delle cellule T CD4 naive con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 in presenza di TGFβ e IL-2 ^11. Come l'emergente Treg sono funzionali in vivo, la manipolazione di molecole che promuovono la differenziazione Treg porta un enorme potenziale per il futuro therapies, per esempio, il trattamento di asma, malattia di Crohn, e trapianto ^11,12. Viceversa, la modulazione terapeutica di molecole per bloccare differenziazione Treg può fornire beneficio in futuro approcci di trattamento combinato dei pazienti con tumori.

Saggi in vitro hanno differenziazione state fondamentali per la descrizione delle modifiche molecolari che sono associati con T sottoinsieme differenziazione cellulare. Al momento, i tentativi sperimentali per cercare o schermo per prodotti genici che la differenziazione delle cellule T sono controllo ostacolata dal fatto che i metodi più comuni di espressione genica ectopica falliscono nelle cellule T naive. Per esempio, elettroporazione e trasduzione retrovirale sono efficaci solo in cellule T attivate. Contrariamente alle aspettative iniziali, trasduzione lentivirali, che è in genere efficace in cellule quiescenti, necessita di pre-attivazione delle cellule T naive dalle citochine ^13. Inoltre, il trasferimento di cDNA o mRNA durante elettroporazionecomporta depolarizzazione della membrana plasmatica, che si conferisce caratteristiche di attivazione delle cellule T e può anche mobilizzare ^{Ca2 +} segnalazione e attivare le proteine ​​NFAT (osservazione inedito e rif. ^14). Analogamente, per la trasduzione retrovirale, le cellule T naive devono essere attivati ​​per 18 – 40 hr. Durante questo tempo, la rottura della membrana nucleare nel corso della divisione cellulare si verifica e consente la successiva integrazione genomica del vettore retrovirale ^15. Questi metodi non sono quindi in grado di affrontare la regolazione molecolare precoce di cellule T incontro iniziale con l'antigene, che è la fase determinante di differenziazione delle cellule T helper.

Trasduzione adenovirale è noto per conferire espressione genica transiente ectopica in un certo numero di tipi di cellule umane che esprimono il recettore umano Coxsackie adenovirus (CAR). Procede senza necessità di attivazione delle cellule o la progressione del ciclo cellulare. L'espressione superficiale di CAR è essenziale per l'attacco del virus efficiente e interiorizzazione, e l'espressione transgenica della versione troncata CARΔ1 sotto una T promotore specifico delle cellule è stato trovato per rendere timociti topo e cellule T suscettibili alle infezioni adenovirale ^16. È importante sottolineare che il transgene non altera sviluppo timociti o differenziazione in vitro di cellule CD4 T naive in diversi sottoinsiemi (dati non mostrati; rif ^17.). Adenovirus-mediata trasduzione di cellule T è stato precedentemente utilizzato per la sovraespressione ^17,18 e knock-down approcci ^19,20. Le cellule T transgeniche possono essere purificati da disponibile in commercio DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref ^17.). Importante, trasduzione adenovirale permette un'elevata espressione di un gene di interesse in cellule T naive senza indurre segni evidenti di attivazione. Le cellule T rimangono ingenui ^(basso CD44, CD62L ^alto) e di riposo (CD25 ^-, CD69 ^-) dopo infection e può essere attivato e differenziate in Treg simili alle cellule non infette.

Produzione di adenovirus ricombinanti può essere raggiunto dopo la trasfezione di cellule con plasmidi HEK293A adenovirali (Figura 1). Questi plasmidi contengono in genere il tipo di adenovirus 5 genoma umano con i geni E1 ed E3 eliminati per rendere adenovirus ricombinanti replicazione-incompetenti ^21. Cellule HEK293A completano carenza di replica in quanto sono stati immortalati attraverso l'integrazione stabile di adenovirus tosato ^22. Dal momento che i vettori adenovirus sono di grandi dimensioni (~ 40 kb) e di conseguenza non è adatto per la tradizionale restrizione enzimatica clonazione, abbiamo impiegato il sistema Gateway. Il gene di interesse viene inizialmente clonato in un vettore voce più piccola, dal quale può essere facilmente trasferito nel vettore adenovirale destinazione tramite reazione di ricombinazione lambda (LR) ^23. Abbiamo costruito la pCAGAdDu vettorecombinando il promotore CAG (pollo promotore actina e CMV enhancer), con una cassetta di espressione contenente siti di LR che fiancheggiano il procariotica CCDB selezione marcatore ^24. Questa cassetta di espressione è fuso ad un sito interno ingresso ribosoma (IRES) elemento che permette coexpression dell'infezione marcatore proteina fluorescente verde rafforzata eucariotica (eGFP), che è fuso ad una sequenza contenente l'ormone della crescita bovina poly (A)-segnale. Abbiamo scelto le sequenze cis-regolatori CAG, poiché il prototipo promotore CMV è risultato essere altamente attivazione-dipendente e pertanto sfavorevole per l'espressione genica in cellule T naive.

Qui, forniamo un protocollo per efficiente in vitro Treg differenziazione e un metodo per trasdurre CD4 naive cellule T senza attivazione (Figura 2). Il metodo consente di espressione genica ectopica o abbattere CD4 precedenti differenziazione delle cellule T allo stato ingenuo. Esso consente di testare l'effetto di un overexpressed gene di interesse durante le prime manifestazioni di segnalazione alla stimolazione TCR iniziale fino T impegno sottoinsieme delle cellule. Nostri esperimenti di validazione forniscono anche la base per stabilire simile all'applicazione adenovirus nella differenziazione di altri sottoinsiemi T cellule quali Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o cellule tfh.