Um Published: June 12, 2013 doi: 10.3791/50332

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Christian Erbel¹, Gregor Rupp¹, Christian M. Helmes¹, Mirjam Tyka¹, Fabian Linden¹, Andreas O. Doesch¹, Hugo A. Katus¹, Christian A. Gleissner¹

¹Department of Cardiology, University of Heidelberg

Macrófagos derivados de monócitos representam um importante componente celular do sistema imune inato e contribuem para muitos processos inflamatórios agudos ou crónicos ^1. Os macrófagos desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, como a aterosclerose ou cancro ^2. Macrófagos apresentam um elevado grau de plasticidade e são capazes de assumir diferentes fenótipos micromilieu dependendo do local ^3. Assim, estudar a diferenciação de macrófagos e heterogeneidade é essencial para aumentar o nosso conhecimento da fisiopatologia de muitas doenças e para permitir a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novas terapias.

Em muitos casos, os modelos de murino são utilizados para investigar a fisiopatologia de doenças específicas. No entanto, estudando a biologia dos macrófagos utilizando modelos de ratos é acompanhada por várias deficiências: (1) A proporção de número de subconjuntos de leucócitos (ou seja, monócitos e granulócitos), em peripHeral sangue de ratos ou de seres humanos varia de forma significativa, sugerindo diferentes papéis dos monócitos na fisiopatologia murino e humano. (2) Existem diferenças substanciais na expressão gênica entre murino e humano monócitos do sangue periférico, sugerindo diferenças substanciais na sua função durante a saúde ea doença ^4. (3) um número de marcadores que são utilizados para identificar os monócitos e macrófagos de murino (F4/80, lyc, etc.) Não existe nas células mielóides humanas, fazendo a transferência dos resultados em modelos do rato para a situação humana bastante difícil.

Assim, a fim de aumentar o nosso conhecimento de diferenciação de macrófagos e heterogeneidade nas doenças humanas, é preciso fazer uso de modelos de trabalho com os macrófagos humanos. Portanto, aqui descrevem um modelo de geração de macrófagos humanos primários, que é fácil de utilizar e permite o estudo dos macrófagos derivados de monócitos humanos in vitro sob várias condições que resultam em diferentes po macrófagotipos larização. Em vários estudos, utilizou-se o modelo in vitro de macrófagos derivados de monócitos humanos primários para analisar a biologia dos macrófagos e a sua relevância potencial para aterosclerose humana ^5-7.

Embora não substitui completamente as experiências com animais ou tecidos humanos, obtidos post-mortem, o modelo aqui descrito permite a identificação e a validação dos mecanismos da doença e alvos terapêuticos que podem ser altamente relevante para várias doenças humanas.

1. Protocolo

1. Prepara Amortecedores como se segue:
   1. Prepare tampão para isolamento PBMC: "tampão de lavagem" = 0,02% EDTA em PBS (0,5 M utilização EDTA).
   2. Preparar tampão de isolamento de monócitos: "MACS tampão de lavagem" = 0,5% de BSA (250 mg) + EDTA a 2 mM (200 ul) + PBS (50 mL). Degas o buffer.
   3. Preparar tampão de coloração de FACS e armazenamento das células: "tampão FACS" = 10% de FCS em PBS e "tampão de fixação" = 1% de PFA em PBS.
2. Desenhar a 30 ml de sangue total a partir de uma veia do antebraço. Use EDTA como anticoagulante.
3. Isolar PBMC (histopaque) como se segue:
   1. Preparar dois tubos estéreis de 50 ml (sem poli-estireno).
   2. Dilui-se o sangue a partir do passo 2 com PBS de 1:1.
   3. Adicionar 25 ml histopaque + 25 ml de sangue total / PBS por tubo. Certifique-se de que histopaque e sangue não se misturam.
   4. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente, sem travão.
   5. Aspirar plasma e descarte.
   6. Aspirar interface de opaco e pipeta limpa 50 ml banheirae.
   7. Adicionar 20 ml de EDTA 0,02% em PBS.
   8. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Elimine o sobrenadante.
   10. Adicionar 10 ml de EDTA 0,02% em PBS.
4. Contar as células como se segue:
   1. Misturar bem com vórtex durante 10 seg.
   2. Tomar 200 mL suspensão celular + 300 ml 0,02% EDTA em PBS + 500 mL de Trypan azul (200-500 células/10 praças, caso contrário alterar o fator de diluição).
5. Realizar isolamento negativo de monócitos como se segue:
   1. Centrifugar as células obtidas no passo 3.10, durante 10 min, 120 x g. Elimine o sobrenadante.
   2. Lavar 2x pellet celular por adição de 10 ml de PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g.
   3. Adicionar 9 ml de água estéril por 3 segundos, adicionar 1 ml PBS 10X.
   4. Lavar mais uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar 10 min, 120 x g.
   5. Conte durante a centrifugação.
   6. Diluir em tampão de EasySep a 5 x 10 ⁷ / ml.
   7. Adicionar 50 ul / ml galo enriquecimento de monócitoscauda.
   8. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
   9. Contas de vórtice para 30 seg.
   10. Adicionar 50 ul de pérolas / mL.
   11. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
   12. Encha com tampão EasySep para completar o volume de 2,5 ml. A solução agora aparece acastanhada.
   13. Coloque em ímã.
   14. Espere 2,5 min à TA. Durante este tempo, as células não monociticas ligados à esfera magnética irá mover-se para a parede do tubo e ficar lá.
   15. Despeje buffer com monócitos não vinculativas em tubo estéril fresco. Esta solução parece esbranquiçada.
   16. Lavar uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g.
6. As células da placa em um prato de plástico ou multiparedes placa a uma densidade de 0,5 x 10 ⁶ / cm ^2. Adicionar 1 ml de meio de cultura / 1 x 10 ⁶ células.
7. Células de cultura sob condições de juros para 6-14 dias.
8. Mudança de mídia depois de 3 dias pela substituição de 50% dos meios de comunicação com a mídia frescos (ver Tabela 1 para detalhes).
9. Depois de seis dias de colheita de células para isolamento do mRNA, citometria de fluxo, Western blotting, etc.

Usando o protocolo acima descrito, que rotineiramente obter 25,1 x 10 ⁶ ± 2,2 x 10 ⁶ monocytes/100 ml de sangue (média ± erro padrão a partir de 26 experiências independentes, a Figura 1A). Pureza de monócitos, conforme determinado por coloração por citometria de fluxo para CD14 é habitualmente superior a 95% (97,1 ± 0,4%, média ± erro padrão de 3 experiências independentes, Figura 1B). A viabilidade das células de monócitos isolados de fresco, como determinado por coloração com azul de tripano é habitualmente superior a 95% (dados não mostrados). Enquanto as células são inicialmente de forma arredondada e float, eles geralmente começam a adesão dentro de algumas horas. A adesão está associada a uma mudança de forma em direção a um "ovo frito" ou a forma fusiforme (Figura 2). Depois de seis dias em cultura com M-CSF (100 ng / ml) com ou sem adição de LDL oxidada (100 ug / ml durante as últimas 24 h), aproximadamente 80% das células não expostas a LDL oxidada são viáveis, ao passo que tretamento com oxLDL resultou em cerca de 70% de células viáveis ​​(Figura 3). A citometria de fluxo, após seis dias de cultura com M-CSF demonstra que enquanto as células continuam a expressar CD45RO marcador de leucócitos, que desregulam o marcador de monócitos CD14 (Figura 4). Condições específicas pode induzir a polarização dos macrófagos - assim macrófagos M1 ou M2-polarizada expressam marcadores típicos como a IL-6, TNF-alfa (M1) ou CD36 e CD206 (M2) (Figura 5). Os macrófagos podem ser mais estudadas em ensaios funcionais. Por exemplo, a absorção de LDL oxidado pode ser estudada usando fluorescência rótulos LDL (Figura 6).

Figura 1. (A) O número de monócitos periféricos obtidos após o isolamento talão negativo. Números de celulares são normalizard para 100 ml de sangue periférico. Dados de 26 experiências independentes. (B), a pureza de monócitos obtidos utilizando isolamento cordão negativo, conforme determinado por citometria de fluxo. Representante frente enredo lado dispersão e histograma de CD14 coloração, controle negativo como linha pontilhada.

Figura 2. Células após 3 e 6 dias de cultura com M-CSF. Barra de escala = 50 mm.

Figura 3. A viabilidade dos macrófagos após 6 dias em cultura com M-CSF ou após 6 dias em cultura com M-CSF e LDL oxidada (100 ug / ml) durante as últimas 24 horas, conforme determinado pelo iodeto de propídio (PI) a coloração. Representativas para a frente do lado scparcelas atter e histogramas para coloração PI.

Figura 4. A citometria de fluxo para o marcador de monócitos CD14 em monócitos isolados de fresco ou macrófagos derivados de monócitos, após seis dias em cultura com M-CSF (100 ng / ml).

Figura 5. A expressão genética de IL-6, TNF-alfa, CD36 e CD206 (receptor de manose) em macrófagos primários humanos diferenciados com M-CSF (100 ng / mL, 6 dias) e polarizado para o fenótipo M1 (LPS, com 100 ng / mL , a expressão do gene e de IFN-gama, com 20 ng / ml, para as últimas 18 h) ou M2 (IL-4, 20 ng / ml durante as últimas 18 horas). estavamedida por PCR quantitativa. * P <0,05, ** P <0,01.

Figura 6. (A) imagem de imunofluorescência de macrófagos FEC-M induzida por macrófagos humanos. Células foram expostas a 10 ug / ml de LDL oxidada marcada com DiI durante 4 horas. Núcleos foram corados com DAPI. Barra de escala = 50 mm. (B) histograma Representante da citometria de fluxo de medição da absorção de DII-ox pelos macrófagos humanos M-CSF-induzidos. Cinza = controle sem tratamento, linha preta = macrófagos ox-tratados.

Tabela 1. Exemplo de condições e marcadores típicos dos tipos de polarização de macrófagos M1 e M2 estabelecidos (ver referências para procedimentos de isolamento ou condições específicas de cultura de células).

Macrófagos derivados de monócitos representam o tipo do sistema imune inato de células chave. Eles desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, incluindo aterosclerose ou cancro ^2. Assim, estudando a biologia dos macrófagos é essencial para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia de muitas doenças e para permitir o desenvolvimento de novas terapias.

Muitos estudos aplicar modelos de rato com superexpressão ou falta certos genes de interesse. No caso dos macrófagos derivados de monócitos, isto não parece ser o melhor caminho para o estudo de processos relevantes para a doença humana, pois há diferenças substanciais entre os monócitos murinos e humanos e células derivadas de monócitos ^4. Assim, os modelos válidos fazendo uso de células humanas primárias parecem uma boa alternativa para estudar mecanismos de doenças relevantes de diferenciação de macrófagos.

Uma vantagem clara do modelo in vitro aqui apresentados é que não se baseia no immortalilinhas celulares zed como THP-1 ou outros ^14-15. Enquanto as linhas de células podem ser facilmente obtidas e contornar a necessidade de uma tira sangue regulares, as linhas celulares são fenotipicamente e funcionalmente não idênticas às células primárias. Assim, Cho et al. Compararam as assinaturas genéticas de macrófagos humanos primários e os comparou com dados publicados anteriormente obtidos THP-1 ^12,14. Eles encontraram uma correlação significativa, mas moderada entre os dois tipos de células, sugerindo que as células THP-1 pode não ser o modelo ideal para estudar a diferenciação de macrófagos e heterogeneidade em muitos casos. Além disso, há vários modelos como diferenciar não aderentes de monócitos como células THP-1 no sentido de macrófagos. Mesmo quando se utiliza o protocolo provavelmente mais aplicável em que as células THP-1 são tratadas com PMA, seguido de cinco dias de repouso em cultura sem PMA (PMAR), as células não inteiramente comportar como células primárias ^16. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que para o estudo de doenças humanasmecanismos a um nível celular, macrófagos primários parecem ser mais adequadas do que as linhas celulares.

A pessoa tem que estar ciente de outros métodos que permitem o isolamento de monócitos humanos primários: aderência ao plástico, cordão de isolamento positivo, ou contra o fluxo de centrifugação elutriação ^17. O coquetel de enriquecimento de monócitos usado aqui contém anticorpos contra o CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A e partículas magnéticas dextrano revestidos. Estes anticorpos ligam-se a epítopos diferentes em monócitos, que podem posteriormente se ligam as partículas magnéticas leucócitos e são mantidas no tubo pelo campo magnético, enquanto todos os monócitos não ligado pode ser transferido para um segundo tubo. Além disso, o cocktail de enriquecimento contém anticorpos para receptores Fc humanos (que são altamente expressos em monócitos), que impedem a ligação não-específica para monócitos. Assim, o método aqui apresentado produz monócitos não activados "intocados" com um elevado grau de pureza.

Existem alguns pontos que precisam ser mantidos em mente quando se aplica esse modelo. Ficoll / Histopaque centrifugação deve ser realizada à temperatura ambiente. EDTA no tampão de lavagem ié necessário para inibir a ligação da integrina de plaquetas dependentes de monócitos. É importante que as sementes de monócitos na densidade apropriada, a fim de conseguir a diferenciação óptima. Ambos os monócitos semeadura também resultados frouxamente ou muito densa no crescimento e diferenciação de qualidade inferior. As opções para modificações incluem semeando as células em substratos específicos ou utilizando diferentes factores de crescimento (por exemplo, GM-CSF, ¹⁸⁾ ou adição de activadores de células específicas (por exemplo, citoquinas ou LPS ^8, Tabela 1).

Utilizando células obtidas a partir de indivíduos diferentes podem resultar em um maior grau de variação em relação às funções celulares específicas. Assim, Martin-Fuentes et al. Demonstraram que os macrófagos derivados de monócitos a partir de diferentes indivíduos exibem diferentes capacidades de absorção de LDL ^19. Interessantemente, estas diferenças permanecem estáveis ​​ao longo do tempo indicando que as variações entre as células de diferentes dadores não sãodevido a diferentes condições experimentais, mas sim refletir diferenças genéticas ou epigenéticas individuais. Por um lado, esta variação maior requer números maiores para obter resultados significativos em experiências específicas, como a captação de LDL oxidada. Por outro lado, essas diferenças também permitir aos pesquisadores estudar as diferenças entre os indivíduos saudáveis ​​e doentes em um nível celular revelando assim novos mecanismos da doença.

Em geral, o protocolo aqui descrito é fácil de usar, reprodutíveis e são úteis para a obtenção de populações de monócitos extremamente puros que podem então ser diferenciadas para macrófagos. Dependendo das condições de cultura, vários tipos de macrófagos derivados de monócitos pode ser estudada permitindo a identificação de processos fisiológicos ou fisiopatológicos específicos relevantes para a doença humana.