Procedimentos simples e reprodutíveis são descritos por fazer três conjuntos de colágeno estruturalmente distintos de um tipo comum disponível comercialmente eu monômero de colágeno. Tipo nativo, o espaçamento de tempo de colagénio fibroso ou espaçamento segmentar longo pode ser construído através da variação das condições a que os 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro bloco de construção de monómero é exposta.
Fibrilhas de colagénio estão presentes na matriz extracelular de tecido animal para fornecer um andaime estrutural e resistência mecânica. Estas fibrilas de colagénio nativo tem uma periodicidade característica de bandas de ~ 67 nm e são formados in vivo, através do conjunto hierárquico de monómeros de colagénio do Tipo I, que são de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. In vitro, através da variação das condições a que a blocos de construção monoméricos são expostos, estruturas únicas que variam em escalas de comprimento até 50 microns pode ser construído, incluindo não só as fibras do tipo nativo, mas também fibras de colagénio e espaçamento de longo prazo espaçamento segmentar. Este trabalho apresenta os procedimentos para a formação das três estruturas diferentes de colagénio a partir de um monómero de colagénio comum disponível comercialmente. Utilizando os protocolos que nós e outros já publicados no passado para fazer estes três tipos tipicamente levam a misturas de estruturas. Em particular, fibrilas unbanded eram geralmente found ao fazer colágeno nativo, e fibras nativas foram muitas vezes presente na tomada de colágeno fibroso espaçamento longo. Estes novos procedimentos têm a vantagem de produzir o desejado tipo de colagénio fibrilar quase exclusivamente. A formação das estruturas desejadas é verificada por imagem usando um microscópio de força atómica.
O colagénio é uma classe de proteínas estruturais que têm uma estrutura helicoidal tripla formada a partir de três cadeias polipeptídicas. Estes monómeros helicoidais triplas adicionais montar de uma maneira hierárquica de modo a formar estruturas progressivamente maiores. Existem pelo menos 28 tipos de colagénio geneticamente diferentes que foram identificadas 1. Combinados, colágenos representam 30% do total de proteínas encontradas em animais, do tipo I, a contabilidade de forma predominante para até 90% de todas as proteínas de colágeno 2. O colágeno tipo I é encontrado como estruturas fibrillous na pele, ligamentos, tendões e ossos. Microscópio de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica (ME) imagens de Tipo I fibras de colágeno nativo normalmente mostram faixas com um período característico de ~ 67 nm (muitas vezes referido como D-faixas) 3-5.
O tipo I é um monómero de colagénio helicoidal triplo heterotrimero constituído por dois α1 idênticos (I) e uma cadeia α2 (I) de cadeia, cada um mais do que ummil aminoácidos de comprimento. É longo e fino com dimensões de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. Colagénio do tipo I de monómero pode ser prontamente obtido por decomposição formados naturalmente estruturas de ordem superior 6. Nós 7 e 8-10 muitos outros têm mostrado que estes blocos de construção monoméricos solúveis em seguida, pode ser usado para reconstruir D-bandados fibrilhas in vitro (Figura 1).
Além de fibrilhas de colagénio nativo, duas outras estruturas mais elevadas de colagénio de ordem foi encontrado para formar in vitro, utilizando o bloco de construção mesmo monómero. As duas estruturas são espaçamento longo fibroso (FLS) e um espaçamento de longo segmentar (SLS) colágeno (Figura 1). FLS colagénio é uma construção fibrillous como colagénio nativo, mas é caracterizada por uma maior periodicidade bandas de colagénio nativo 11. In vitro, o colagénio FLS forma quando o monómero é combinada com colágeno α1-glicoproteína ácida <sup> 12. FLS colagénio tem sido observada in vivo, bem como, embora raramente 13. Colagénio SLS é descrito como cristais porque os monómeros são alinhados no registo como numa estrutura de cristal 14. SLS colagénio forma-se quando o monómero de colagénio é combinado com o trifosfato de adenosina (ATP) 15. Que ocorre naturalmente colagénio SLS foi observado no meio de cultura de fibroblastos, mas não em amostras de tecido extraídos, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho e falta de características topográficas distintas 16.
O objetivo deste artigo é apresentar os procedimentos detalhados para a tomada de fibrilas de colágeno nativas como FLS bem e colágeno SLS que mesmo o pesquisador mais inexperiente pode reproduzir. Usando disponíveis comercialmente a partir de materiais avançados, temos tentado fazer os protocolos tão simples quanto possível e ainda tê-los funcionar de forma confiável. Nós também detalhes como usar um AFM para caracterizar a estrutura do colágeno diferentes que são feitas. Este trabalho será benéfico para pesquisadores que querem estudar uma ou mais dessas estruturas superiores de colágeno de ordem e / ou utilizá-los como precursores em outras aplicações, mas que não têm o conhecimento ou simplesmente não querem trabalhar com amostras de tecido.
Purificou-monómero de colagénio é estável a pH baixo e temperatura e a formação de fibrilhas de colagénio nativo essencialmente envolve o aumento do pH e temperatura da solução de monómero de colagénio. Procedimentos para a reconstituição de fibrilas de colágeno em faixas de monômeros existem há mais de 50 anos. O procedimento que o nosso laboratório usado nos nossos primeiros estudos com colagénio de 15 anos atrás 7 foi baseada em procedimentos resumidos por Chapman e colaboradores em 1986 10. As condições para a formação de fibrilas de colagénio em que trabalhos anteriores foram 0,18 mg / ml de colagénio em monómeros de Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) tampão a 34 ° C. O inconveniente deste e de outros procedimentos que tentámos é que existem sempre fibrilas unbanded formadas juntamente com as fibrilas desejados sombreadas. As nossas novas condições são ~ 0,3 mg / ml de colagénio em monómeros fosfato 100 mM e 100 mM de KCl, a pH 7 deixados a 37 ° C durante 3-4 horas. O procedimentomento aqui descrito difere em todos os aspectos do processo anterior para a tomada de fibrilhas de colagénio nativo. Mas o mais notavelmente, dobramos a força iónica, aumentando a concentração de tampão e adição de 100 mM de KCl. O aumento da força iônica na formação mais consistente de fibrilas de colágeno exclusivamente em faixas.
Em nossa experiência, as únicas vezes que este procedimento não tem produzido o colágeno tipo nativo foi quando a solução de monômero de colágeno foi passado data recomendada pelo fabricante de uso. Quando isto ocorre, o que é observado varia de menos fibrilas que são todos unbanded para muitas fibrilas ainda observados, mas predominantemente unbanded. Note que monômero colágeno expirado muitas vezes pode ainda ser utilizado com sucesso para fazer colágeno nativo, mas quando falha, o monómero de novo colágeno deve definitivamente ser comprado.
FLS foi identificado pela primeira vez por Highberger et al. 17 em preparações de colagénio creditados Orekhovich et al. 18. Mais estudos levaram Highberger e Schmitt a concluir que se tratava de glicoproteína α1-ácido que promove a formação de FLS 12. Nós foram posteriormente capaz de replicar o procedimento para fazer o colagénio FLS pela combinação de monómero de colagénio disponíveis comercialmente e α1-glicoproteína ácida a pH baixo e, lentamente, permitindo que o pH a subir por diálise da mistura contra água durante 24 h 11. Apresentamos agora uma modificação do referido processo de diálise por o monómero de colagénio contra água em primeiro lugar e simplesmente combinando-o com α1-glicoproteína ácida em água para formar colagénio FLS. As condições para FLS colagénio montagem aqui descritos são muito menos demorado. O monómero de colagénio ainda necessita de ser pré-dialisado contra água, mas ele pode ser feito em grandes quantidades e, em seguida, armazenada a 4 ° C de forma estável até ser utilizado. Isso gera novo procedimento predominantemente fls fibrilas de colágeno bandados.
Pela nossa experiência, α1-ácido glicoproteína com um teor de proteína e água inferior combinado, e, por inferência, maior teor de açúcar, é fundamental para o sucesso fazendo fibrilas de fls. Nós normalmente verificar com o fabricante que o lote glicoproteína α1-ácido que usamos tem um combinado% de teor de proteína e água de 82 ou menos. E, como com o procedimento para a síntese de colagénio nativo, de monómero de colagénio que é demasiado antigo pode também resultar na incapacidade de produzir colagénio FLS. Além disso, a pureza da água utilizada para a diálise é crítica neste processo. Por exemplo, a diálise do monómero de colagénio mesmo contra ~ 8 MΩ.cm vez de> 18 água resulta MΩ.cm em uma solução de colagénio que não irá formar colagénio FLS.
Um dos três tipos de colagénio de fibrila, o mais fácil de fazer é colagénio SLS. A primeira preparação de SLS foi descrito por Schmitt e colegas de trabalho 15. Nós publicamos uma adaptação desse procedimento há 12 anos para fazer colágeno SLS usando coll disponível comercialmenteagen 14. O procedimento implica simplesmente combinar 2 mg / ml de ATP e 0,5 mg / ml de colagénio em monómeros de 0,05% (v / v) de ácido acético a pH 3,5, e deixando a mistura à temperatura ambiente durante a noite.
Na nossa experiência, o aspecto crítico da montagem SLS que deve ser controlado é o pH da solução de reacção. SLS montado em condições mais básicas (~ pH 3,6-3,9) resulta em aglomerados de agregados de cristalitos. Condições mais ácidas (pH ~ 2,9-3,2) resulta em mais finas, cristalitos mais separados do que os montados sob as condições ideais de pH 3,3-3,5. PHs reação fora deste intervalo (<2,8 e> 4) não produzem qualquer colágeno SLS. No passado, foi ajustado o pH da mistura de reacção por adição de ácido acético. Para simplificar o processo ainda mais, neste manuscrito, introduzimos um tampão de glicina-HCl para controlar o pH.
As três estruturas diferentes de colagénio formadas a partir dos protocolos descritos acima têm caráctercaracterísticas humanístico que só pode ser discernido por instrumentos capazes de resolução de nanômetros. Colágeno nativo e FLS são caracterizados por bandas periodicidades de ~ 67 nm e ~ 270 nm. A dimensão mais longa do colagénio SLS é apenas ~ 360 nm. Nós descrevemos especificamente como usamos um AFM para caracterizar as três estruturas de colágeno diferentes. No entanto, qualquer operação AFM em contacto ou o modo de contacto intermitente com qualquer sonda de AFM com <raio nm 10 deve também ser capaz de imagem destas estruturas de colagénio. Além disso, a microscopia de electrões pode ser, e tem sido utilizado para caracterizar as estruturas de colagénio 19.
A principal vantagem destes processos é que eles produzem, predominantemente, o colagénio desejado construir. A única outra forma de colagénio que se encontra nestas reacções é o monómero de partida, o que é muitas vezes visível no fundo das imagens de AFM. No caso do colagénio nativo e FLS, eles podem ser facilmente separados a partir de mais do unreamonómero CTED por centrifugação repetida e lavagem do resultante nativo ou colagénio FLS pellet com água.
Apresentámos procedimentos simples e fiável para a tomada nativas, FLS e colagénio SLS utilizando avançadas, materiais de partida disponíveis comercialmente. O monómero de colagénio utilizada em todos estes processos é comercialmente disponível na forma purificada. α1-glicoproteína ácida e ATP também estão ambos disponíveis comercialmente.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a todos os muitos passados de graduação, estudantes de graduação e pós-doutoramento que contribuíram com seu tempo e esforço para o estudo da fibrogênese colágeno em nosso laboratório. As Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá tem continuamente desde o financiamento para os nossos estudos de colágeno.
Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
mica | Ted Pella | 53 | |
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |