高内涵筛选新的信号主管跨膜受体的鉴定方法。此方法是适合于大规模的自动化,并允许的预测<em在体内</em>蛋白结合和在哺乳动物细胞中的蛋白复合物的亚细胞定位。
生长因子受体信号转导的维持细胞的增殖和分化是必要的,需要严格控制。信号转导是由的外部配体结合到跨膜受体,激活下游的信号通路。一个关键的调节有丝分裂信号是Grb2的,模块化的内部SH2(Src同源2)域两侧的两个SH3结构域,缺乏酶的活性的蛋白质组成。 Grb2的是组成与GTP酶的儿子作者-Sevenless(SOS)相关联,通过其N-末端SH3结构域。 SH2结构域的Grb2的结合生长因子受体磷酸化酪氨酸残基偶联受体激活的SOS-RAS-MAP激酶信号级联。此外,作为正的或负的稳压器的信令和受体的内吞作用的Grb2的其他角色已被描述。 Grb2的模块化的组合物,表明,它可以停靠各种受体和转导E信号沿许多不同的途径1-3。
这里描述的是一个简单的显微镜检测,监控招募到质膜的Grb2的。它适于从一个试验,其测量变化的亚细胞定位的绿色荧光蛋白(GFP)的标签Grb2的响应于刺激4-6。质膜受体结合GRB2如激活表皮生长因子受体(EGFR)招GFP-Grb2的cDNA表达的质膜后,随后搬迁到在细胞中的胞内舱。为了识别体内 Grb2的蛋白复合物的,这种技术可以用于执行了全基因组基于高含量屏幕的变化Grb2的亚细胞定位。在下面详细描述的制备的cDNA的表达克隆,转染和图像采集。用于识别蛋白质相互作用伙伴的其他基因组的方法,如酵母双-HY相比杂种,这种技术允许在哺乳动物细胞中的蛋白复合物的可视化,在通过一个简单的显微镜为基础的检测的相互作用的亚细胞站点。因此,定性特征,诸如图案的本地化可评估,以及作为定量的相互作用强度。
表达克隆是一种强大的工具,已经被用于在过去,如病毒受体和血细胞抗原12,以确定新的细胞成分。在这里,我们描述了一种方法,以方便识别新的假定的信号转导受体结合GRB2。
在协议中,有几个关键步骤。
Grb2的易位检测已被用于其他组的小分子抑制剂的表皮生长因子受体激酶的活化6。在这种情况下,具体激活的表皮生长因子受体与配体引起招募Grb2的质膜。破坏它们之间的相互作用,然后,可以使用小分子化合物的研究。同样,可以设想,可以采用的siRNA屏幕识别参与EGFR-Grb2的信令或其他Grb2的结合如c-KIT或促红细胞生成素受体的细胞生长因子受体的内源性基因。因此,存在多个潜在的应用这种技术。一个类似的方法可以适用于GFP标记的报告系统为其他适配器分子如SHC,加布或IRS。
使用这种基于细胞的测定,在哺乳动物细胞中的一个主要优点是,它能够识别的生理相对evant的相互作用。该检测方法是读出的蛋白复合物的形成,但更重要的是,有关的相互作用是在正确的子蜂窝站点监视。在这方面,这种技术克服工件如酵母双杂交,或在体外测定方法从其他的蛋白-蛋白相互作用的。应该指出,间接的相互作用也可能导致Grb2的招聘。类似的,具有约束力的合作伙伴的转录调控作用可能是通过cDNA表达。为了区分这些可能性,它是需要进行适当的辅助检测区分直接和间接结合效果。
总之,GFP适配器的分子易位试验的承诺全基因组的筛选和药物发现应用潜力。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了医学研究理事会和玛丽居里国际重返社会补助金计划(JKV)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |