Вирусный отслеживание генетически определенных нервной системы
Summary
Метод трассировки синаптически связанных нейронов описано. Мы используем TVA специфику вверх клетки, чтобы исследовать, является ли клетка интерес населения получает синаптические вход из генетически определены типы клеток.
Abstract
Классические методы для изучения нейронных цепей довольно низкой пропускной способностью. Транссинаптических вирусов, в частности, псевдобешенства (PRV) и вирус бешенства (RABV), а в последнее время вирус везикулярного стоматита (VSV), для изучения схемы, становится все более популярным. Эти методы более высокого пропускная способность использовать вирусы, которые передают между нейронами либо в антероградной или обратном направлении.
Недавно измененные RABV для моносинаптических ретроградной трассировка была разработана. (Рис. 1А). В этом методе, гликопротеин (G) гена будет удален из вирусного генома, и снабжение только в целевых нейронов. Инфекция специфики достигается путем замещения химерных G, состоящий из внеклеточного домена ASLV-гликопротеина и цитоплазматический домен RABV-G (A / RG), для нормального RABV-G 1. Это химерных G специально заражает клетки, экспрессирующие рецептор TVA 1. Ген, кодирующий TVA можно было Delivered с помощью различных методов 2-8. После RABV G-инфекции TVA-экспрессирующих нейронов, RABV может передать другим, синаптически связанных нейронов в обратном направлении по природе своей G которая была совместно поставляется с рецептором TVA. Этот метод называет сравнительно большое число входов (5-10%) 2 на определенный тип клеток, обеспечивая выборку всех входов на определенный тип клеток стартера.
Мы недавно измененные эту технику, чтобы использовать VSV как транссинаптических индикатора 9. VSV имеет ряд преимуществ, в том числе скорость экспрессии генов. Здесь мы подробно новых вирусных система отслеживания использования VSV полезно для зондирования микросхемы с повышенным разрешением. Хотя первоначально опубликованных стратегий Wickersham и соавт. 4 и Beier и др. 9. Разрешение маркировки любых нейронов, которые проецируются на первично-инфицированных TVA-выражение-клетки, здесь VSV был разработан для передачи только на ТВ-Экспрессирующие клетки (рис. 1б). Вирус сначала pseudotyped с RABV-G, чтобы позволить инфекции нейронов вниз по течению от TVA-экспрессирующих нейронов. После заражения этой первой популяции клеток, вирус выпущен только заразить TVA-экспрессирующих клеток. Потому что транссинаптических вирусное распространение ограничено TVA-экспрессирующих клеток, наличие или отсутствие подключения от определенных типов клеток могут быть изучены с высоким разрешением. Экспериментальная схема этих экспериментах показано на рисунке 2. Здесь мы покажем модель цепи, что направление селективности в сетчатке мышей. Мы рассматриваем возможность подключения звездообразования клетки амакринные (SAC) в ганглиозных клеток сетчатки (РГК).
Protocol
Discussion
Использование вирусов для изучения нейронных цепей является относительно высокая пропускная способность метод анализа связной нейронов. Однако, создавая как VSV и RABV вирионы не является тривиальной. Хотя протокол, перечисленные выше для спасения вируса из ДНК, то она по-прежнему низко?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Шон Уилан за помощь в спасении рекомбинантные варианты VSV, и Didem Гоз и Райан Chrenek для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана HHMI (CLC), и # NS068012-01 (КТБ).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
Referencias
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
