piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler
Summary
Vi beskriver en metode for å genetisk modifisere primære humane T-celler med et transgen hjelp av ikke-virale<em> PiggyBac</em> Transposon systemet. T-celler modifisert til å bruke<em> PiggyBac</em> Transposon system utstillingen stabilt transgene uttrykk.
Abstract
Den piggyBac transposon systemet er naturlig aktiv, opprinnelig stammer fra kål Looper møll 1,2. Dette ikke-viral systemet er plasmid basert, oftest benytte to plasmider med en uttrykker piggyBac transposase enzym og en transposon plasmid harboring genet (er) av interesse mellom inverterte gjenta elementer som er nødvendig for genoverføring aktivitet. PiggyBac medierer genoverføring gjennom en "cut and paste" mekanisme hvorved transposase integrerer transposon segment inn i genomet av målcellen (r) av interesse. PiggyBac har demonstrert effektiv genet levering aktivitet i et bredt utvalg av insekt 1,2, pattedyr 3-5, og humant cells6 inkludert primære humane T-celler 7,8. Nylig ble en hyperaktiv piggyBac transposase generert forbedre genoverføring effektivitet 9,10.
Humane T-lymfocytter er av klinisk interest for adoptiv immunterapi av kreft 11. Av notatet, har den første kliniske studie med transposon modifisering av humane T-celler ved hjelp av Sleeping beauty transposon system er godkjent 12. Vi har tidligere evaluert nytten av piggyBac som en ikke-viral metodikk for genetisk modifisering av humane T-celler. Vi fant piggyBac å være effektiv i genetisk modifisering av humane T-celler med en reporter-genet og et ikke-immunogent induserbart selvmord genet 7. Analyse av genomisk integrering områder avdekket mangel på preferanse for integrering i eller i nærheten av kjente proto-onkogener 13. Vi brukte piggyBac til gen-endre cytotoksiske T-lymfocytter til å bære et kimært antigen reseptoren rettet mot tumor antigen HER2, og funnet ut at gen-modifisert T-celler mediert målrettet dreping av HER2-positive tumorceller in vitro og in vivo i en orthotopic musemodell 14. Vi har også brukt piggyBacå generere humane T-celler som er resistente mot rapamycin, som bør være nyttige i kreft terapier hvor rapamycin er utnyttet 15.
Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for å bruke piggyBac å genmodifisere primære humane T-celler. Dette inkluderer isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra humant blod etterfulgt av kultur, genmodifikasjon, og aktivering av T-celler. For hensikten med denne rapporten, ble T-celler modifisert med et rapportørgen (eGFP) for analyse og kvantifisering av genekspresjon ved strømningscytometri.
PiggyBac kan brukes til å modifisere humane T-celler med en rekke gener av interesse. Selv om vi har benyttet piggyBac å dirigere T-celler til tumorantigener 14, har vi også brukt piggyBac å legge et induserbart sikkerhetsbryter for å eliminere genmodifiserte celler hvis nødvendig 7. Den store lastekapasitet piggyBac har også gjort det mulig genoverføring aven stor rapamycin motstandsdyktig mTOR molekyl (15 kb) 15. Derfor presenterer vi en ikke-viral metodikk for stabil gen-modifisering av primære humane T-celler for en lang rekke formål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet heri muliggjør stabil transgenet modifisering av primære humane T-lymfocytter. Vi har tidligere testet bruken av piggyBac transposon systemet å modifisere T-celler til å uttrykke et rapportørgen (i mer enn 4 uker), en ikke-immunogent selvmord gen, et chimerisk antigen reseptor for adoptiv immunterapi (i mer enn 100 dager), og til ingeniør motstand mot immunsuppressive medisiner 7,13-15. Ikke-virale modifikasjon av T-celler for adoptiv immunterapi og andre programmer bør være…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS støttes delvis av HHMI Med i Grad Training Grant gjennom TBMM Program. MHW støttes delvis av en karriereutvikling pris fra Department of Veterans Affairs og sjenerøs støtte fra Dr. og Mrs. Harold M. Selzman. Dette arbeidet ble også støttet delvis av NIH lymfom SPORE tilskudd P50CA126752 og NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Referencias
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
