Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l'origine dérivé de la ^1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l'enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d'intérêt entre répétées inversées d'éléments qui sont nécessaires à l'activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un "couper et coller" mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d'intérêt. PiggyBac a démontré l'efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de ^1,2 insecte, de mammifère ^3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires ^7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l'efficacité de transfert de gènes ^9,10.

Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l'immunothérapie adoptive du cancer ^11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le ^12. Nous avons déjà évalué l'utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide ^7. L'analyse des sites d'intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes ^13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d'antigène chimérique dirigé contre l'antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales de vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique ^14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée ^15.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l'activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l'analyse et la quantification de l'expression génique par cytométrie en flux.

PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d'intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux ^14, nous avons également utilisé piggyBac d'ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d'éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire ^7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) ^15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.