Summary

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Published: November 05, 2012
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale<em> PiggyBac</em> Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l'aide de la<em> PiggyBac</em> Transposon exposition expression du transgène système stable.

Abstract

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l'origine dérivé de la 1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l'enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d'intérêt entre répétées inversées d'éléments qui sont nécessaires à l'activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un "couper et coller" mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d'intérêt. PiggyBac a démontré l'efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de 1,2 insecte, de mammifère 3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires 7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l'efficacité de transfert de gènes 9,10.

Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l'immunothérapie adoptive du cancer 11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le 12. Nous avons déjà évalué l'utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide 7. L'analyse des sites d'intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes 13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d'antigène chimérique dirigé contre l'antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales de vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique 14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée 15.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l'activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l'analyse et la quantification de l'expression génique par cytométrie en flux.

PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d'intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux 14, nous avons également utilisé piggyBac d'ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d'éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire 7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) 15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.

Protocol

Jour 0 1. Isolation des PBMC à partir de sang humain Recueillir 20 ml de sang humain frais en utilisant ponction veineuse dans des tubes Vacutainer Na-héparine. Mélanger le sang et avancée RPMI 1640 en 1:1 (v / v). Ajouter 20 ml Lymphoprep moyen d'un tube à centrifuger de 50 ml (25 ° C). Lentement couche de 25-30 ml de sang RPMI 1640 mélange sur le dessus du Lymphoprep. Centrifuger à 400 xg pendant 40 min sans freins. Recueillir les…

Representative Results

Un schéma montrant les étapes de la modification génétique de lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est illustré à la figure 1. Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès des auteurs. Un schemtic démontrant les étapes génétiquement modifiés lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est showin dans la figure 2. Il est nécessaire d'activer les cellules T dans le but de les amener à se diviser, se développer et se propager dans la cultu…

Discussion

Le procédé décrit ici permet de modifier transgène stable de lymphocytes T humains primaires. Nous avons déjà testé l'utilisation du système piggyBac transposon pour modifier des cellules T pour exprimer un gène rapporteur (pour plus de 4 semaines), un gène suicide non immunogène, un récepteur d'antigène chimérique pour l'immunothérapie adoptive (pour plus de 100 jours), et à concevoir une résistance aux médicaments immunosuppresseurs 7,13-15. Non-virale modification des…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SS est soutenu en partie par le HHMI Med en Grad Subvention de formation par l'intermédiaire du Programme TBMM. MHW est soutenu en partie par une bourse de développement de carrière du ministère des Anciens combattants et le soutien généreux de M. et Mme Harold M. Selzman. Ce travail a également été soutenu en partie par le NIH lymphome SPORE P50CA126752 subvention et le NIH R01 DK093660.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Lympholyte Cedarlane CL5015  
Advanced RPMI 1,640 LifeTechnologies 12633020  
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3008803  
GlutaMAX-I Supplement LifeTechnologies 35050-061  
Human IL-15 Recombinant Protein eBioscience 14-8159  
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362  
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S  
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza VPA-1002  
CD8-APC Southern Biotech 9536-11  
Anti-Human CD3 eBioscience 16-0037-81  
Anti-Human CD28 BD Pharmingen 555725  
24 Well Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 353047  
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 351147  
      Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

Referencias

  1. Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
  2. Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
  3. Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
  4. Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
  5. Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
  6. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
  7. Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
  8. Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
  9. Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
  10. Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
  11. Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
  12. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
  13. Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
  14. Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
  15. Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
  16. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
  17. Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).

Play Video

Citar este artículo
Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).

View Video