piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان
Summary
وصفنا طريقة لتعديل خلايا T وراثيا الأساسي الإنسان مع التحوير باستخدام غير الفيروسية<em> piggyBac</em> ينقول النظام. خلايا T تعديلها لاستخدام<em> piggyBac</em> نظام ينقول التعبير المعرض التحوير مستقرة.
Abstract
نظام ينقول piggyBac نشط بشكل طبيعي، والمستمدة أصلا من 1،2 الملفوف فراشة وبير. هذا النظام غير الفيروسية هو البلازميد القائم، والأكثر شيوعا استخدام البلازميدات 2 مع واحد يعبر عن انزيم transposase piggyBac وينقول البلازميد إيواء الجينات (ق) في المصالح بين عناصر تكرار مقلوب وهي مطلوبة من أجل نقل الجينات النشاط. PiggyBac نقل الجينات من خلال يتوسط و"قص ولصق" آلية يمكن من خلالها للtransposase يدمج الجزء ينقول في جينوم الخلية الهدف (ق) من الفائدة. أثبتت كفاءة النشاط PiggyBac توصيل الجينات في مجموعة متنوعة واسعة من 1،2 الحشرات، الثدييات 3-5، و الإنسان بما في ذلك cells6 الأولية خلايا T الإنسان 7،8. مؤخرا، تم إنشاء transposase piggyBac مفرط تحسين كفاءة نقل الجينات 9،10.
الإنسان الخلايا الليمفاوية T هي من intere السريريةسانت لعلاج مناعي لسرطان بالتبني 11. من المذكرة، تمت الموافقة على أول محاكمة سريرية شملت ينقول تعديل خلايا T الإنسان باستخدام نظام ينقول الجميلة النائمة 12. لدينا تقييم من قبل الأداة المساعدة من piggyBac كمنهجية غير الفيروسية للالتعديل الوراثي للخلايا T الإنسان. وجدنا piggyBac لتكون فعالة في التعديل الوراثي للخلايا T الإنسان مع الجينات مراسل والانتحار غير محرض مناعة الجين 7. كشف تحليل لمواقع التكامل الجينومية عدم وجود تفضيل للاندماج الجينات المسرطنة بروتو أو بالقرب منها معروفة 13. كنا piggyBac لتعديل الجينات السامة للخلايا الليمفاوية T للقيام مستقبلات مستضد خيالية موجهة ضد مستضد الورم HER2، ووجد أن الجين بوساطة استهدفت خلايا T-معدلة قتل HER2 إيجابية الخلايا السرطانية في التجارب المختبرية والحية في نموذج الفأر مثلي 14. وقد استخدمنا أيضا piggyBacعلى توليد خلايا T المقاومة للrapamycin الإنسان، التي ينبغي أن تكون مفيدة في علاج السرطان حيث يستخدم rapamycin 15.
هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام piggyBac لتعديل وراثيا خلايا T الأساسي الإنسان. وهذا يشمل عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من دم الإنسان تليها الثقافة والتحوير الجيني، وتنشيط خلايا T. لغرض هذا التقرير، تم تعديل الخلايا T مع الجينات مراسل (EGFP) للتحليل الكمي والتعبير الجيني من قبل التدفق الخلوي.
ويمكن استخدام خلايا لتعديل PiggyBac T الإنسان مع مجموعة متنوعة من الجينات في المصالح. على الرغم من أننا قد استخدمت لتوجيه الخلايا piggyBac لمستضدات الأورام T 14، وقد استخدمنا أيضا piggyBac لإضافة مفتاح السلامة محرض من أجل القضاء على خلايا الجينات تعديل إذا لزم الأمر 7. وقد مكنت طاقة شحن كبيرة من piggyBac أيضا نقل الجينات منلمقاومة كبيرة rapamycin جزيء mTOR (15 KB) 15. ولذلك، فإننا نقدم منهجية غير مستقرة للفيروسات لتعديل الجينات من الخلايا الأولية T الإنسان لطائفة واسعة من الأغراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموضحة هنا يمكن تعديل مستقرة التحوير الأولية الخلايا الليمفاوية T الإنسان. لقد اختبرنا سابقا استخدام نظام ينقول piggyBac لتعديل خلايا T للتعبير عن الجينات مراسل (لأكثر من 4 أسابيع)، جين الانتحار غير مناعة، ومستقبلات مستضد خيالية لعلاج مناعي بالتبني (لأكثر م…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم SS في جزء من البحر المتوسط إلى HHMI غراد التدريب من خلال برنامج المنح TBMM. ويدعم MHW في جزء من مهنة جائزة التنمية من وزارة شؤون المحاربين القدامى، وبدعم سخي من الدكتور هارولد والسيدة Selzman M.. وأيد أيضا هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة سرطان الغدد الليمفاوية P50CA126752 منحة المعاهد الوطنية للصحة وSPORE R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
Referencias
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
