Cet article décrit en détail un protocole d'électroporation in utero du cortex cérébral et l'hippocampe à E14.5 chez la souris. Nous montrons aussi que cette méthode est précieuse pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.
En électroporation in utero (IUE) est devenue une technique puissante pour étudier le développement de différentes régions du système nerveux embryonnaire 1-5. À ce jour, cet outil a été largement utilisée pour étudier la régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation et la migration neuronale en particulier dans les pays en développement du cortex cérébral 6-8. Ici, nous détaillons notre protocole d'électroporation in utero du cortex cérébral et l'hippocampe et fournir la preuve que cette approche peut être utilisée pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.
Visualisation et la manipulation des neurones en cultures primaires ont contribué à une meilleure compréhension des processus impliqués dans la dendrite, la colonne vertébrale et le développement des synapses. Cependant les neurones en développement in vitro ne sont pas exposés à tous les signaux physiologiques qui peuvent affecter dendrite et / ou la formation la colonne vertébrale et de l'entretien au cours du développement normal. Notre connaissance des structures dendritiques et la colonne vertébrale <em> in vivo chez la souris de type sauvage ou mutant vient surtout à partir d'observations en utilisant la méthode de Golgi-Cox 9. Toutefois, la coloration de Golgi est considéré comme imprévisible. En effet, des groupes de cellules nerveuses et des faisceaux de fibres sont étiquetés de manière aléatoire, avec des zones particulières apparaissant souvent complètement taché alors que les zones adjacentes sont dépourvue de coloration. Des études récentes ont montré que l'IUE de constructions fluorescentes représente une méthode intéressante alternative à étudier dendrites, des épines, ainsi que des synapses chez les souris mutantes / type sauvage 10-11 (figure 1A). Ailleurs par rapport à la génération de souris knock-out, IUE représente une approche rapide pour effectuer le gain et la perte de fonction des études de la population spécifique de cellules pendant une fenêtre temporelle spécifique. En outre, l'IUE a été utilisé avec succès dans l'expression des gènes inductibles ou inductible ARNi se rapproche d'affiner le contrôle temporel sur l'expression d'un gène ou shRNA 12. Ces avantages de l'IUE ont ainsi opened de nouvelles dimensions à étudier l'effet de l'expression des gènes / suppression sur les dendrites et les épines non seulement dans certaines structures cérébrales (figure 1B), mais aussi à un moment spécifique du développement (figure 1C).
Enfin, IUE fournit un outil utile pour identifier les interactions fonctionnelles entre les gènes impliqués dans la dendrite, la colonne vertébrale et / ou le développement des synapses. En effet, contrairement à d'autres méthodes de transfert de gènes tels que le virus, il est facile de combiner plusieurs ARNi ou des transgènes dans la même population de cellules.
En résumé, l'IUE est une méthode puissante qui a déjà contribué à la caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le fonctionnement du cerveau et de la maladie et il devrait également être utile dans l'étude des dendrites et des épines.
IUE est un outil puissant pour manipuler l'expression des gènes, non seulement dans l'espace mais aussi dans le temps. Nous montrons ici que cette technique peut être utilisée pour visualiser et manipuler génétiquement des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l'hippocampe de souris. Outre les avantages précédemment cités, il est intéressant de noter que l'IUE, contrairement à la méthode de Golgi, peut être combiné avec l'immunohistochimie ou hybridation in situ, qui permet par exemple de phénotype des cellules électroporées. Il est également important de mentionner que cette procédure ne provoque pas de malformations cérébrales évidentes en dépit de son caractère invasif relative. En outre, au niveau cellulaire, IUE ne modifie pas les propriétés électrophysiologiques de l'électroporation neurones 13. Alors que notre démonstration se concentre sur la visualisation des morphologies dendritiques et la colonne vertébrale, IUE de neurones corticaux ou l'hippocampe à E14.5 pourrait également être utilisée pour étudier d'autres événements de développement tels que la formation et l'orientation des axones. En ajouterition, le même genre de protocole pourrait être mis en œuvre à d'autres stades du développement embryonnaire de cibler des populations différentes. Par exemple, un paradigme développemental électroporation très tard corticale à E18.5 peut être effectuée pour diriger l'expression dans les progéniteurs astrocytaires 1. De même, alors une électroporation de l'hippocampe à E14.5 permet de cibler CA1-CA3 progéniteurs neuronaux pyramidales et denté progénitrices de cellules granulaires dans le même temps, une électroporation fin hippocampique (E18.5 ou postnatale précoce) permettrait de cibler les différents granules denté progéniteurs 14. Dans ce cas, le volume injecté de l'ADN peut être augmenté, ainsi que l'intensité du courant.
Transgènes introduits par IUE semblent rester épisomique et sont donc perdus à partir de cellules suivantes des divisions cellulaires successives. Dans les cellules post-mitotiques comme les neurones, cependant, les transgènes épisomiques restent actifs pendant des mois après l'électroporation permettant études à long terme 13, 15. Dans notre étude, nous avons observé la GFP lumineux + cellules jusqu'à 7 semaines après la naissance (le dernier point de temps, nous avons analysé) indiquant que l'embryon ciblage des corticales ou hippocampiques précurseurs neuronaux en utilisant les résultats IUE dans l'expression persistante du transgène à partir du début points dans le temps de développement en place à l'âge adulte.
Une limitation du courant de la technique, c'est qu'il est difficile d'exercer un contrôle précis sur le nombre total de cellules électroporées. Toutefois, en diminuant le volume injecté de la solution d'ADN, nous avons montré qu'il est possible d'étiqueter quelques cellules et de visualiser l'arborisation dendritique des cellules GFP + isolés ainsi que leurs épines. La dimension de la zone transfectée peut également être réglée en modifiant les paramètres de l'électroporation tels que l'intensité du courant et le nombre d'impulsions ou le diamètre des pales d'électroporation.
Au total IUE est une méthode qui est facile à mettre en œuvre, rapide etefficace pour étudier les dendrites et les épines in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Kathleen Mathers, le Dr Jean-Philippe Mocho et le Dr Yolanda Torres Saavedra pour leur aide pour effectuer électroporation de utero dans les procédures aseptiques, et Wood Hayley pour son aide pour préparer les plans.
EP a été soutenue par une fédération à long terme des sociétés européennes de biochimie (FEBS) et une bourse du Medical Research Council (MRC) de bourses de développement de carrière, titulaire de l'AMM par une subvention du Wellcome Trust à Elizabeth Fisher et Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW par un EMBO long terme de bourses et RA par une bourse d'études de la MRC. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) et par un FG Grant-in-Aid de la Medical Research Council (U117570528) à
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |