마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency – 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.
일반적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 1 가변 조건 하에서 배양해 수 있습니다. 그러나 culturing위한 효과적인 시스템이 이러한 세포를 확립하는 것은 쉽지 않다. 문화 조건 hESCs과 hiPSCs의 pluripotency 수여 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 최적화 및 문화 방법의 표준화가 중요합니다.
hESC 라인의 설립이 먼저 피더 세포와 태아 소 혈청 (FBS) 함유 배지 2로 MEFs를 사용하여 설명되었다. 다음으로, FBS는 hESCs 3의 증식을 향상 녹아웃 혈청 교체 (KSR)과 FGF2,로 대체되었습니다. 마지막으로, 공급기 – 무료 문화 시스템에 Matrigel 코팅 접시에 culturing 세포를 활성화 KSR-포함된 에어컨 매체 (매체가 MEFs에 의해 조건) 4. 그 후, hESCs 문화 조건은 화학적 defin에 피더 무료 문화쪽으로 이사5-7 에드 조건입니다. 또한, 외부의 무료 구성 요소를 사용 병원균과 동물 단백질 배양 방법에 의한 잠재적인 오염을 피하기 위해 8 설립되었습니다.
향상된 상태를 얻으려면 마우스 피더 세포는 인간 세포 라인 (예 : 태아의 근육과 피부 세포 9, 성인 피부 세포 10, 포피의 섬유아 세포 11-12, amniotic mesenchymal 세포 13)로 대체되었습니다. 그러나 인간의 포피 fibroblast 파생 피더 레이어를 사용하여 undifferentiated hESCs을 유지의 효율성은 14 Activin의 분비의 낮은 수준으로 인해 마우스 피더 세포의 그만큼 높은 아니다. 분명히, 마우스 및 인간 피더 세포에 의한 성장 인자의 생산에 분명 차이가있다.
마우스와 인간 피더 세포 transcriptomes의 분석은지지와 비지지 세포 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 외인성 FGF2는 maintai 데 중요hESCs과 hiPSCs의 자기 갱신을 닝과 Tgfβ1, Activin와 피더 세포의 괴물 (BMP 길항제)의 표현을 규제하는 핵심 요소로 확인되었습니다. Activin은 OCT4, SOX2 및 hESCs 15-16의 NANOG의 표현을 유발을 보여줘왔다.
장기적인 문화의 경우 hESCs 및 hiPSCs들은 undifferentiated 상태를 유지하기 위해 mitotically inactivated MEFs이나 Matrigel – 코팅 접시에 MEF-CM (MEF-에어컨 중간)에서 피더없는 조건 하에서 재배 할 수 있습니다. 그들이 직접 hESCs의 성장에 영향을 미칠 이후 두 문화 조건의 성공은 완전히 피더 세포의 품질에 따라 달라집니다.
여기서는 마우스 배아 섬유아 세포의 격리와 문화 (MEFs)에 대한 최적화된 방법이 갖추어진 매체 (CM)과 미디어 사이를 Activin의 수준을 평가하는 효소 결합 면역 분석 (엘리사)의 준비를 제시.
여기서 제시 MEFs 절연 절차는 hESCs과 hiPSCs을위한 표준화된 문화 조건의 설립을 가능하게합니다. 또한 피더 세포에 의해 시토킨 생산을 평가하는 데 사용 엘리사 기반 시스템은 MEF-파생 에어컨 미디어의 품질에 유용한 지표입니다. 지원 섬유아 세포를 제공하는 마우스 변형 (CF1)의 정기 점검은 문화 미디어의 배치 – 투 – 배치 변화를 방지하는 데 필요합니다. 더욱이, 그것은 동시에 세포의 일관된 품질을 얻기 위해 여러 생쥐에서 배아를 분리하는 것이 좋습니다. 물론 갓 격리 MEFs는 P0과 P1에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 또한 inactivated MEFs는 세포 배양을위한 요구 사항에 따라 적절한 양의 aliquots에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 보통 약 250.000 세포 문화 hESCs 및 IPS 세포에 6 – 잘 접시의 한 우물로 도금한다. 설립 및 최적화 방법은 정기적으로 diffe 간의 다양성을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다실험을 임대.
The authors have nothing to disclose.
. 2,007 Greber 외에 발표된대로 Activin에게 엘리사 프로토콜을 설정하기위한 박사 보리스 Greber에 대한 특별 감사합니다. 우리는 그래픽 개요를 준비하기위한 부인 모니카 Shevack들에게 특별히 감사를드립니다. 우리는 촬영 전, 동안의 모든 도움과 귀중한 제안 박사 Heiko Fuchs 매우 감사하고 있습니다. 우리는 MEFs와 CM의 지속적인 공급을 유지하기위한 Adjaye 연구실, 특히 엘리자베스 Socha의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 우리는 또한 그들의 영구 지원 MPIMG의 동물 시설에서 우리의 동료를 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 맥스 플랑크 사회와 추진하는 사업 [BMBF, 보조금 번호 0315717A] ERASysBio의 파트너 + EU FP7의 방어율-NET 플러스 체계 하에서 지원 계획.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |