Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

1. Isolamento dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) Le seguenti due fasi vengono eseguite sotto condizioni non asettiche. Sacrifica un topo in stato di gravidanza (CF1, Harlan, USA) a 13 o 14 DPC (giorni post-coitum) per dislocazione cervicale. Dissect le corna uterini, sciacquare brevemente nel 70% (v / v) etanolo e posto in una provetta Falcon contenente PBS senza Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). Le seguenti operazioni sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizzando strumenti sterili. Mettere le corna uterine in una capsula Petri e separare ogni embrione dalla sua placenta e il sacco embrionale. Staccare testa e gli organi rosse, lavare in PBS e mettere tutti gli embrioni in un piatto pulito Petri. Tritare finemente il tessuto usando una lama di rasoio sterile fino diventa possibile pipettare. Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA (Gibco, Invitrogen), including 100 unità Kunitz di DNasi I (USB), per embrione. Trasferire il tessuto in una provetta Falcon da 50 ml e incubare per 15 min a 37 ° C. Dopo ogni 5 minuti di incubazione, le cellule dissociare pipettando su e giù accuratamente. Inattivare la tripsina aggiungendo circa 1 volume di terreno MEF appena preparato. MEF terreno di coltura (componenti per fare 500 ml di media, mescolare tutti i componenti e filtro): 450 ml di DMEM, 50 ml di FBS (10% (v / v)), 5 ml di 200 mM L-glutammina (1/100 (v / v)), 5 ml di penicillina-streptomicina (1/100 (v / v)). Centrifugare le cellule con bassa velocità (300 xg), 5 min, rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media MEF caldo. Tavola circa un numero di celle che è equivalente a 3-4 embrioni in ciascun (TPP) pallone T150 rivestiti con 0,2% di gelatina (gelatina di pelle bovina, tipo B, Sigma) per 2 h. I fibroblasti (P0, il passaggio 0) sono le uniche cellule che hanno la possibilità di allegare alla gelatina rivestite fiaschi. </li> Idealmente, le cellule sono confluenti 80-90% dopo 24 ore e in questa fase una parte importante del P0 cellule viene congelato per uso futuro. Espandere il restante T150 pallone (s) di P0 cellule fino P3 o P4, e quindi inattivare usare come alimentatori per replate hESC o per produrre mezzo condizionato (CM). 2. Inattivazione e placcatura MEF (Feeder Preparazione Cells) Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche. Cappotto T150 palloni con il 0,2% di gelatina ed incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore. Diluire mitomicina C in PBS (1 mg / ml) e filtrare. Aspirare media da MEF e lavare con PBS senza Ca 2 + Mg 2 +. Trasferire 20 ml di mezzo contenente 10 ug / ml di mitomicina C il MEF. Incubare per 2 ore a 37 ° C con mitomicina C contenente il mezzo poi lavate due volte con PBS, Tripsinizzare, centrifuga (per 5 minuti a 300 xg) e risospendere le cellule in mezzo caldo. Contare le cellule e la piastra ad una densità di 56.000 cellule / cm 2 in fiasche T150 e di utilizzare per la produzione CM per i successivi 6 giorni. 3. Condizionata Medium (CM) Preparazione Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche. Il giorno dopo la piastratura inattivato MEF ad una densità di 56.000 cellule / cm 2 sostituire il mezzo MEF con il mezzo hESC (UM, media incondizionata) (0,5 ml / cm 2) appena completato con 4 ng / ml di FGF2. Raccogliere CM da beute alimentazione dopo 24 h di incubazione e aggiungere mezzo fresco contenente hESC 4 ng / ml di FGF2 agli alimentatori. Ripetere questa procedura per i prossimi 6 giorni. Ogni negozio raccolti CM giorni a -20 ° C. Dopo 6 giorni mescolare tutte le aliquote di medio e filtro (Corning, 0,22 micron, PAS). Effettuare aliquote di 50 ml e conservare a -80 ° C. Supplemento CM con ulteriori 4 ng / ml di FGF2 prima di aggiungere al hESC coltivate Matrigel. </ Li> 4. Misura di Activin A in Media condizionata (ELISA) 15 Portare tutti i campioni e reagenti a temperatura ambiente. Diluire la cattura anticorpale (Human \ Mouse \ Rat activina A MAB, R & D Systems) in PBS con 1% BSA, aggiungere alla micropiastra (100 pl / pozzetto) ed incubare una notte a temperatura ambiente. Dopo 24 ore lavare i pozzetti tre volte con PBST (PBS con 0,05% Tween 20) (300 pl / pozzetto), allora blocco (1% BSA / PBS, 300 pl / pozzetto) per 1 ora a RT. In questo tempo preparare una Activin A (R & D Systems) curva standard, tra cui 7 diluizioni (concentrazione inferiore a 30 ng / ml) e il campione in bianco. Il campo lineare di lavoro del Activin A è tra 0,25 e 32 ng / ml. Aggiungi duplicati degli standard e dei campioni ai pozzetti (100 pl / pozzetto) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi. Aggiungere il secondario (biotinilato) anticorpi (Human / Mouse / Rat Biotinylated Activin A MAb, R & D Systems) (0.25 ug / ml in 1% BSA / PBS) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi, aggiungere streptavidina-HRP (diluita in 1% BSA / PBS, R & D Systems) e incubare per 20 minuti a RT. Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato (Quantikine, R & D Systems) e incubare per 30 min a RT al buio. Aggiungere 100 ml di soluzione di arresto (Quantikine, R & D Systems) in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente. Set Lettore di micropiastre (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) a 450 nm, con correzione lunghezza d'onda a 540 o 570 nm, per determinare la densità ottica di ciascun pozzetto. 5. Risultati rappresentativi Lo schema generale della procedura di isolamento è presentato in Figura 1. La morfologia tipica delle hESC hiPSCs e coltivate in condizioni differenti è presentata in Figura 2. La morfologia dei MEF e cellule feeder inattivate usati per preparare CM è presentato nella Figura 3. In generale, le celle devono essere confluenti 24 ore dopo l'isolamento e pronti per essere congelati o espanso. Tuttavia, a volte potrebbe richiedere 2-3 giorni prima di ottenere colture confluenti. Il CM deve essere preparato dalle cellule al passaggio 4 e non dopo. Questo è fondamentale perché le cellule primarie può essere ampliato per 4-5 passaggi prima dell'inizio della senescenza. La citochina, Activin A, è considerato il principale fattore critico secreto dalle cellule di alimentazione per il sostegno di crescita indifferenziata di cellule pluripotenti 14. La misurazione del livello di Activin A in CM (figura 4) è un saggio quantitativo molto conveniente per monitorare la qualità di MEF. Figura 1. Una rappresentazione schematica della procedura di isolamento MEF. ONTENUTO "> Figura 2. La morfologia tipica delle hESC indifferenziati coltivate in presenza di (A), le cellule di alimentazione (B) mezzo condizionato e media (C) definita. La morfologia tipica di hiPSCs coltivate in presenza di (D, E) cellule di alimentazione. Figura 3. La morfologia tipica di fibroblasti embrionali di topo (MEF). (A) Passaggio 0 (P0) due giorni dopo placcatura / isolamento, (B) inattivato strato alimentatore ad una densità di 56.000 cellule / cm 2. Figura 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a base di misurazioni della concentrazione di Activin A in mezzo condizionato (CM) prepared con fibroblasti embrionali di topo derivate dal ceppo di topi CF1. CM è stato raccolto per 6 giorni e poi sommati. CM "1" e CM "2" si riferiscono a diversi lotti di media e di messaggistica unificata ai media incondizionati. Poiché la funzione del processo di condizionamento viene Activin A secrezione nel mezzo di MEF, Activin Un quasi impercettibile a UM.