Summary

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Published: April 02, 2012
doi:

Summary

بروتوكول يصف نظام فعال وقابلة للتكرار نموذج لدراسة فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) الكمون وتنشيط. الفحص توظف متجانسة الثقافات الخلايا العصبية متعاطف، ويسمح للتشريح الجزيئية للفيروس الخلايا العصبية التفاعلات باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات بما في ذلك تدخل الجيش الملكي النيبالي والتعبير من البروتينات المؤتلف.

Abstract

فيروس الهربس البسيط نوع 1 (HSV-1) يضع العدوى الكامنة مدى الحياة في الخلايا العصبية الطرفية. هذا خزان كامن هو مصدر الأحداث المتكررة التي تكفل إعادة تنشيط النقل وتسهم في المرض السريري. الأدوية المضادة للفيروسات الحالية لا تؤثر على خزان كامنة وأنه لا توجد لقاحات. في حين أن تفاصيل الجزيئي للتكرار التحللي هي جيدة تتميز، وآليات السيطرة على كمون في الخلايا العصبية لا تزال بعيدة المنال. مشتق من فهمنا الحالي للكمون من الدراسات المجراة في استخدام النماذج الحيوانية الصغيرة، التي لا غنى عنها لتحديد الاحتياجات الجينات الفيروسية ودور الاستجابات المناعية. ومع ذلك، فإنه من المستحيل التمييز بين آثار محددة على علاقة الفيروسات الخلايا العصبية من عواقب وأعم من العدوى بوساطة خلايا المناعة أو الدعم غير العصبية في الحيوانات الحية. وبالإضافة إلى ذلك، التجارب على الحيوانات غير مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، ومحدودة من حيث الخيارات المتاحة لمعالجة مضيفالعمليات. للتغلب على هذه القيود، وهناك حاجة ماسة إلى نظام الخلايا العصبية فقط أن يستنسخ في خصائص الجسم الحي من الكمون وإعادة تنشيط لكنه لم يقدم فوائد زراعة الأنسجة من حيث التجانس وسهولة الوصول إليها.

نحن هنا يقدم في المختبر باستخدام نموذج مثقف الخلايا العصبية متعاطف الأولية من العقد الفئران عنق الرحم متفوقة (SCG) (الشكل 1) لدراسة HSV-1 الكمون وتنشيط يلائم معظم إن لم يكن كل من المعايير المطلوبة. بعد القضاء على الخلايا غير العصبية، يصاب شبه متجانسة TrkA + الثقافات الخلايا العصبية مع HSV-1 في وجود الأسيكلوفير (ACV) لقمع تكرار التحللي. التالية ACV إزالة، غير منتجة HSV-1 الإصابات التي تعرض بأمانة وضعت بصمات بكفاءة مقبولة من الكمون. والجدير بالذكر أن mRNAs التحللي، والبروتينات، والفيروسات المعدية تصبح غير قابلة للكشف، حتى في حالة عدم وجود اختيار، ولكن استتار المصاحب لنص (LAT) صريحةايون استمرت في نوى الخلايا العصبية. تتم المحافظة على الجينوم الفيروسي في عدد نسخة من متوسط ​​25 في الخلايا العصبية، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتكرار منتجة عن طريق التداخل مع PI3-كيناز / AKT إشارات أو انسحاب بسيط من عامل نمو الأعصاب 1. والمؤتلف HSV-1 EGFP ترميز تنصهر في Us11 بروتين فيروسي التحللي يوفر وظيفية، في الوقت الحقيقي وعلامة للحصول على النسخ الناتجة عن إعادة تنشيط أن كميا بسهولة. بالإضافة إلى العلاج الكيميائي، ويمكن منهجيات الوراثية مثل تسليم الحمض النووي الريبي التدخل أو الجينات النواقل lentiviral تطبيقها بنجاح على نظام السماح للدراسات الآلية التي من الصعب جدا، إن لم يكن مستحيلا، في الحيوانات. وباختصار، فإن SCG المستندة إلى HSV-1 كمون / تنشيط نظام يوفر قوية، وأداة ضرورية لكشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في HSV1 الكمون وتنشيط الخلايا العصبية في، لغزا محيرا منذ وقت طويل في علم الفيروسات التي قد تقدم حلا رؤى جديدة لتطوير علاجات جديدة هدف تيكان كامنا خزان هربس.

Protocol

1. العزلة والثقافة من الخلايا العصبية SCG من أجنة الفئران لتوفير سياق مفيد لفهم هذا البروتوكول، ومناقشة شاملة للأدب في وقت سابق ان وضع أساليب للثقافة العصبية SCG، بما في ذلك أساسا لثقافة SCG في المختبر، ركائز لوحة طلاء، ومكونات مصل ا…

Discussion

هذه الثقافة الخلايا العصبية الأولية ونظام عدوى يوفر طريقة بسيطة وفعالة لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء HSV-1 الكمون وتنشيط. نظام يلخص بأمانة بصمات المقبولة من الكمون المحددة في كل من الإصابات البشرية والحيوانات الحية من النماذج. عندما يكون الفيروس كا…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر المقيمين على اقتراحاتهم مدروس التي ساعدت على تحسين هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المنح لMVC (NS21072، HD23315)، ACW (GM61139، S10RR017970) والدردشة (AI073898، GM056927) من المعاهد الوطنية للصحة. وأيد عضو الكنيست في جزء من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (5T32 AI007180).

Materials

Reagent Company Catalog# Comments
70μm nylon filter( cell strainer) BD Biosciences 352350  
1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) Invitrogen 14175 w/o CaCl2 and MgCl2
1x Minimum Essential Media (MEM) Invitrogen 11095-080  
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma F0503 prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C
96-well flat well bottom TC plates Corning 3599  
Acyclovir Calbiochem 114798 prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C
Aphidicolin Calbiochem 178273 prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C
B-27 Supplement Invitrogen 17504-44  
Collagenase Sigma C2674 prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C
D-(+)-Glucose Sigma G6152 prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C
L-Glutamine Invitrogen 25030-081  
Laminin Sigma L2020 prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O
Leibovit’z L-15 media Invitrogen 11415  
Nerve Growth Factor Harlan Laboratories BT.5017 prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C
Neurobasal medium Invitrogen 12348  
Phosphonoacetic acid (PAA) Sigma P6909 prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P0899 prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C
Rat-tail collagen Millipore 08-115 Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O
Trichostatin A Sigma T8552 prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C
Trypsin 2.5% Invitrogen 15090-04  

Referencias

  1. Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
  2. Johnson, M. I., Fedoroff, S., Richardson, A. Primary cultures of sympathetic ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 71-94 (2001).
  3. Letourneau, P. C., Fedoroff, S., Richardson, A. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. Protocols for Neural Cell Culture. , 245-254 (2001).
  4. Price, J. P., Brewer, G. J., Fedoroff, S., Richardson, A. Serum-free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , 255-264 (2001).
  5. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
  6. Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. The family Herpesviridae: A brief introduction. Fields Virology. 2, 2381-2397 (2001).
  7. Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network. Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).
  8. Tomishima, M. J., Enquist, L. W. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).
  9. Ch’ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).
  10. Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins. J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).
  11. Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides. J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).
  12. Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1 (2005).
  13. Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O’Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene. J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).
  14. Newcomb, W. W., Brown, J. C. Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation. J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).
  15. Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production. J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).
  16. Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro. J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).
  17. Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells. J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).
  18. Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons. J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).
  19. Harris, R. A., Preston, C. M. Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918. J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).
  20. Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).
  21. Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae. J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).
  22. Stroop, W. G., Banks, M. C. Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo. Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).
  23. Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).
  24. Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS. J. Virol. 58, 203-211 (1986).
  25. Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro. J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).
  26. Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation. Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).
  27. Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1. Otology & Neurotology. , (2012).

Play Video

Citar este artículo
Kobayashi, M., Kim, J., Camarena, V., Roehm, P. C., Chao, M. V., Wilson, A. C., Mohr, I. A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation. J. Vis. Exp. (62), e3823, doi:10.3791/3823 (2012).

View Video