وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي
Summary
وعموما الأغشية الحيوية الميكروبية التي تشكلها مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. وحيد الخلية تحليل هذه القطعان يتطلب استخدام للصحفيين فلوري. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور ورصد عدة subpopulationswithin<em> ب. الرقيقة</em> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي.
Abstract
تشكيل بيوفيلم هو سمة عامة للجميع تقريبا 1-6 البكتيريا. عندما البكتيريا تشكل الأغشية الحيوية، وخلايا المغطى في المصفوفة خارج الخلية التي شكلت في معظمها من البروتينات وexopolysaccharides، من بين عوامل أخرى 7-10. المغطى المجتمع الميكروبية داخل بيوفيلم يظهر في كثير من الأحيان التمييز بين subpopulation متميزة من الخلايا المتخصصة 11-17. هذه القطعان تتعايش وغالبا ما تظهر التنظيم المكاني والزماني في بيوفيلم 18-21.
تشكيل بيوفيلم في نموذج العصوية الرقيقة الحي يتطلب التفريق بين مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. فيما بينها، وsubpopulation من المنتجين مصفوفة، المسؤولة عن انتاج وإفراز المصفوفة خارج الخلية من بيوفيلم أمر ضروري لتشكيل بيوفيلم 11،19. وبالتالي، التفريق بين المنتجين المصفوفة هو السمة المميزة لتشكيل بيوفيلم في B. الرقيقة.
وقد استخدمنا للصحفيين فلوري لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين مصفوفة في الأغشية الحيوية من B. 15،19،22-24 الرقيقة. بشكل ملموس، لاحظنا أن subpopulation من المنتجين مصفوفة يفرق ردا على وجود الذات المنتجة خارج الخلية إشارة surfactin 25. ومن المثير للاهتمام، ويتم إنتاج surfactin بواسطة جزء من السكان من خلايا متخصصة تختلف عن subpopulation من المنتجين مصفوفة 15.
وقد فصلنا في هذا التقرير على نهج الفنية اللازمة لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين والمنتجين surfactin مصفوفة داخل الأغشية الرقيقة من B.. للقيام بذلك، يتم إدراج صحفيين فلوري من الجينات اللازمة لإنتاج مصفوفة والإنتاج surfactin في كروموسوم من B. الرقيقة. يتم التعبير للصحفيين فقط في جزء من السكان من الخلايا المتخصصة. ثم، يمكن أن تكون القطعانرصدها باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي (انظر الشكل 1).
حقيقة أن مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا المتخصصة التعايش داخل المجتمعات المتعددة الخلايا من البكتيريا يعطينا وجهة نظر مختلفة حول تنظيم التعبير الجيني في بدائيات النوى. هذا البروتوكول لا يتناول هذه الظاهرة بشكل تجريبي، ويمكن أن تتكيف بسهولة مع أي نموذج العمل الأخرى، لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم التجانس المظهري داخل المجتمع الميكروبية.
Protocol
Discussion
حقيقة أن المجتمعات البكتيرية تظهر مجموعات سكانية فرعية من الخلايا معربا عن مجموعة محددة من الأدلة الجينات تعقيد المجتمعات الميكروبية 33،34. يجب أن هذا البروتوكول يساعد على تحديد ما إذا كان يقتصر على التعبير عن أي الجينات التي تهم جزء من السكان خاصة من خلايا متخص…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل برنامج محقق بحوث الشباب، من مركز أبحاث الأمراض المعدية (ZINF) من جامعة فورتسبورغ. C-خوان غارسيا بيتانكور، وهو زميل الدكتوراه من كلية الدراسات العليا في علوم الحياة (GSLS) من جامعة فورتسبورغ.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
Referencias
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
- Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
- O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
- Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
- Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
- Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
- Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
- Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
- Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
- Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
- Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).
