만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징
Summary
우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.
Abstract
중추 신경계 (CNS)의 리간드 게이트 이온 채널은 심각한 의료 및 사회적 결과와 다양한 조건에 연루된다. 예를 들어, 담배 흡연을 통해 니코틴에 대한 중독은 조기 사망 전 세계 (세계 보건기구)의 주요 원인이며 가능성이 뇌 1 이온 채널 배포판의 변경에 의해 발생합니다. 1-3 뇌 조직의 nicotinic 아세틸콜린 수용체 (nAChRs)의 증가 숫자 모두 설치류 동물과 인간 결과에서 만성 니코틴 노출. 마찬가지로, glutamatergic GluN1 또는 GluA1 채널의 변경 같은 코카인, 암페타민과 약물 4-6와 같은 다른 중독성 약물에 sensitization를 실행에 연루되었습니다.
따라서 특정 이온 채널의 유통 및 표현 패턴을 매핑하고 계량하는 능력은 중독의 메커니즘을 이해하는데에 매우 중요합니다. 뇌의 특정 지역과 관련된 EF의 연구개별 약물 fects 같은 방사성 리간드와 같은 기술의 출현에 의해 승진되었다. 그러나 방사성 리간드 바인딩의 낮은 공간 해상도는 뉴런의 특정 subtypes에 리간드 게이트 이온 채널을 계량하는 능력을 방지한다.
같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 여러 색상의 변형과 같은 유전적으로 인코딩 형광등 기자는 생물학 7 분야에 혁명을했습니다. 유전자 태그를 추가하여 하나가 생체내 7-10에서 단백질을 시각화 수있는 내생 단백질에 형광 기자. 프로브로 fluorescently 태그 단백질의 한 가지 이점은 nonspecificity하고 대상 단백질에 대한 접근의 문제가 항체 이용 철폐입니다. 우리는 교양 transfected 세포 11 포스터 공명 에너지 전송 (무서워)를 사용하여 수용체 어셈블리의 연구를 활성화 fluorescently 라벨 nAChRs,이 전략을 사용했습니다. 최근에는 우리가 knoc를 사용한K-의 스펙트럼 공촛점 현미경을 통해 12 CNS의 뉴런에서 submicrometer 해상도의 수용체 전의 생체내의 정확한 양을 정함있게 α4 nAChR의 subunits (α4YFP를) 태그로 노란색 형광 단백질과 엔지니어 마우스에 접근합니다. 타겟팅 형광 장물에 돌연변이 wildtype 생쥐에서 태그가 지정되지 않은 수용체에 비해 표현과 수용체의 규제의 정상적인 수준을 생산, 내생 현장에와 토착 발기인의 통제하에 통합됩니다. 이 장물의 접근법은 fluorescently 다른 이온 채널에 태그를 확장하고 CNS에있는 수용체를 시각화하고 quantifying의 강력한 접근 방식을 제공 할 수 있습니다.
본 논문에서 우리는 만성 니코틴에 노출된 후 특정 CNS의 뉴런에 nAChR 표현의 변화를 계량하기위한 방법론을 설명합니다. 우리의 방법은 미니 삼투 펌프 주입, intracardiac 관류 고정, 이미징 및 fluorescently 태그가 nicotinic 레크 리에의 분석을 포함에서 eptor의 subunits α4YFP 장물의 생쥐 (그림 1). 우리는 자세하게 정확하게 α4YFP 형광 신호를 얻기 위해 autofluoresent 신호를 뺀것하는 선형 스펙트럼 unmixing 알고리즘과 함께 스펙트럼 공촛점 현미경을 사용하여 우리의 이미징 방법론에 대해 설명 고정 뇌 tissue.We에서 autofluorescence을 최소화하기 위해 고정 기술을 최적화했습니다. 마지막으로, 우리는 해마의 중간 perforant 경로에 α4YFP 수용체의 만성 니코틴을 유발 upregulation 결과를 보여줍니다.
Protocol
Discussion
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
앤서니 Renda는 빅토리아 대학원 화목 상을 대학에 의해 지원되었다. Myre와 위너 프 리드 그렇소 기금, 혁신 기금, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금을위한 캐나다 재단 -이 연구는 자연 과학 및 캐나다의 발견 그랜트 공학 연구 협의회, NARSAD 젊은 탐정 수상 (RN까지), 빅토리아 재단에 의해 지원되었다 그리고 자연 과학 및 캐나다 연구 도구 및 계측 그랜트 공학 연구 협의회. 우리는 우수한 마우스 축산을 위해 질리언 맥케이, 크리스티나 반즈, 에리얼 설리반, 제니퍼 맥도날드와 다니엘 Morgado 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
Referencias
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