Summary

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

리프트 밸리 열병 바이러스 MP – 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP – 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

출혈성 발열, 신경 장애 또는 인간의 실명 및 고속 낙태와 ruminants 1 태아의보기 흉한 것의 원인이 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)는, 선택한 에이전트 및 위험 그룹 3 병원체를 중복 HHS / USDA으로 분류되었습니다. 그것은 가족 Bunyaviridae에Phlebovirus에 속한이 가족의 가장 악성 멤버 중 하나입니다. RVFV MP – 12 백신 스트레인 2,3뿐만 아니라 ZH548 및 ZH501를 포함한 야생 형 RVFV의 변종 4-6에 대한 몇 가지 역방향 유전 시스템은 2006 년부터 개발되었습니다. MP – 12 변형은 (위험 그룹 2 병원체가 아닌 선택 대리인되는) 몇몇은의 돌연변이 M과 L – 세그먼트로 높은 감쇠 있지만, 여전히 기능 독기를 인코딩 악성 S – 세그먼트 RNA 3, 운반 요소, NSS. 그것으로 effic 복제하면서 rMP12 – C13type (C13type)는 NSS ORF의 삭제 – 프레임의 69 % 나르는 것은, 모든 알려진 NSS 기능을 결여ient는 VeroE6 세포의 MP – 12 타입 – I IFN에 부족 않습니다. NSS는 인터페론 (IFN) – 베타 mRNA 7,8를 포함하여 호스트 전사의 종료 – 오프를 유도하고 사후 translational 수준에서 두 번 좌초 RNA – 의존 단백질 키나제 (PKR)의 저하를 추진하고 있습니다. 9,10 IFN – 베타 transcriptionally입니다 인터페론 규제 요인 3 (IRF – 3), NF – KB 및 활성 단백질 1 (AP – 1) 및 IFN-alpha/beta 수용체에 IFN – 베타의 바인딩 (IFNAR)에 의해 upregulated는 IFN – 알파의 전사를 촉진 NSS에 의한 IFN – 베타 유전자를 포함하여 호스트 전사 억제 바이러스는 복제에 대한 응답으로 그 ISGs의 유전자 upregulations을 방지 반면, 호스트 항바이러스 활동을 유도 유전자 또는 다른 인터페론 자극 유전자 (ISGs) 11, 비록 IRF – 3, NF – KB와 활성제 단백질 1 (AP – 1) RVFV7에 의해 활성화될 수 있습니다. . 따라서, NSS 추가 MP – 12을 자제하고, IFN – 베타 억제 기능을 폐지하여 호스트 타고난 면역 반응을 향상시킬 수있는 좋은 대상입니다. 여기에우리는 재조합 MP – 12 인코딩 변이된 NSS 창출을위한 프로토콜을 설명하고, IFN – 베타 mRNA 합성을 억제하는 기능을 부족한 NSS 돌연변이를 확인하기 위해 검사 방법의 예를 제공합니다. 타고난 면역에 그 본질적인 역할뿐만 아니라, 입력 – I IFN이 돌기 세포 및 적응 면역 반응의 유도 12-14의 성숙을 위해 중요합니다. 따라서, NSS의 돌연변이 타입 – I IFN을 유도하는 것이 더 감쇠 있지만, 동시에 접종 방식에 적합하게 후보자 야생 형 MP – 12보다 자극 호스트 면역 반응에 더 효율적입니다.

Protocol

1. 플라스미드 DNAs 2 재조합 MP – 12 인코딩 NSS 변이 (들)의 복구 보급 아기 햄스터 신장 (BHK) / T7 – 9 세포 15, 안정적으로 표현 T7 RNA 효소, 최소 필수 매체 6 cm 요리로 (가상) 알파 10% 태아 소 혈청 (FBS를 포함하는 (Invitrogen, 고양이 # 32561037) ), 페니실린 – 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML) (Invitrogen, 고양이 # 15140122), 600 μg / hygromycin B의 ML (Cellgro, 고…

Discussion

RVFV에 대한 유전학 시스템을 리버스는 T7 프로 모터 2,4,5 드나 마우스 3 인간 4 POL – I 프로 모터를 이용하여 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 원고에서는, 우리는 BHK/T7-9 세포 15되는 안정 표현 T7 RNA 효소를 사용하여 재조합 RVFV MP – 12 계통을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 바이러스 복구의 효율 BHK/T7-9 세포의 상태에 따라 다양, plasmids의 양을, transfected 세포 ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 부여 5 번 우수 서양 지역 센터 (WRCE)를 통해 U54 AI057156 – 07, 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 1 R01 AI08764301 – A1, 그리고 대학에서 백신 개발을위한 Sealy 센터에서 내부 자금으로 투자되었다 텍사스 의료 지점.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  

Referencias

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

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