Rekombinant adeno-associeret virus (rAAVs) vektorer bliver stadig mere værdifuld for<em> In vivo</em> Studier i dyr. Vi beskriver, hvordan rAAVs kan fremstilles i laboratoriet, og hvordan disse vektorer kan titered at give en præcis aflæsning af antallet af smitsomme producerede partikler.
I de senere år rekombinant adeno-associeret virale vektorer (AAV) er blevet stadig mere værdifuld for in vivo undersøgelser på dyr, og er også i øjeblikket testet i humane kliniske undersøgelser. Vildtype-AAV er en ikke-patogene medlem af parvoviridae familien og i sagens natur replikationskompetente mangelfuld. Den brede transduktion profil, lavt immunforsvar samt den stærke og vedvarende transgenet udtryk opnås med disse vektorer har gjort dem til et populært og alsidigt værktøj for in vitro og de vivo gen levering. rAAVs kan nemt og billigt produceret i laboratoriet, og baseret på deres gunstige sikkerhedsprofil, er generelt får en lav sikkerhed klassifikation. Her beskriver vi en metode til produktion og titering af kimære rAAVs indeholder kapsid proteiner af både AAV1 og AAV2. Brugen af disse såkaldte kimære vektorer kombinerer fordelene af begge forældres serotyper såsom høje titre bestande (AAV1) og rensningved affinitets kromatografi (AAV2). Disse AAV serotyper er de bedst undersøgte af alle AAV serotyper, og individuelt har en bred infektivitet mønster. De kimære vektorer, der er beskrevet her, bør have smitsomme egenskaber AAV1 og AAV2 og kan således forventes at inficere en lang række væv, herunder neuroner, skeletmuskulatur, bugspytkirtel, nyre blandt andre. Den metode, der beskrives her bruger heparin kolonne oprensning, en metode som menes at give en højere viral titer og renere virale forberedelser end andre rensning metoder, såsom centrifugering gennem en caesiumchlorid gradient. Derudover beskriver vi, hvordan disse vektorer kan hurtigt og nemt titered at give nøjagtig måling af antallet af smitsomme producerede partikler.
rAAV vektorer bliver mere og mere værdifulde for in vivo undersøgelser på dyr. Her har vi beskrevet en simpel og billig protokol til fremstilling rAAVs, der kan lette den udbredte anvendelse af denne nyttige vektor ved at undgå de dyre outsourcing af virus produktion til virksomheder. Protokollen (baseret på reference 1) beskriver produktion af kimære rAAV1 / 2 vektorer indeholdende kapsid proteiner fra begge forældrenes serotyper med lige nøgletal 4. Rensning af rAAV vektorer ved binding til heparin kolonner afhængig af ekspressionen af AAV2 kapsid proteiner, men kan kombineres med serotyper end AAV1 skitseret her. Derudover har AAV6 blevet rapporteret at binde sig til heparin, dog med en reduceret affinitet, og potentielt kunne renses med heparin kolonner ved hjælp af denne procedure 5,6. Det skal dog bemærkes, at andre serotyper vil kræve forskellige koncentrationer af NaCl for heparin kolonne eluering 5,7.
Emballage rAAV genomer viste sig at være optimalt mellem 4,1 og 4,9 kb med en kraftig reduktion i emballage effektivitet på op til 5,2 KB 8. Denne emballage grænse kan betragtes som den største ulempe ved rAAV systemet, da celletype-specifikke regulering af transgene udtryk normalt opnås ved store cis handler elementer, som ikke kan rummes inden for de små AAV partikler. For at overvinde lav titer partier, såsom dem, der skyldes at forsøge at pakke gener, der er tæt på AAV pakning grænsen vi kombinerer separate viral partier koncentreret til 250 μl i en 500 μl parti, snarere end at tilføje PBS som beskrevet i trin 6.3. Pålidelig celle-typespecifikke transduktion kan opnås ved at kombinere Cre-driver mus og betingede rAAV kassetter (se nedenfor) for at undgå at strække emballagen grænse.
Det skal bemærkes, mens denne protokol forsøger at give let at følge instruktionerne på produktion af høj titer rAAV, det kræver tilstedeværelse af AAV2 kapsid protein fragmenter for rensning ved heparin affinitetskromatografi. Serotyper end AAV2 skal renses ved hjælp af alternative procedurer 9. En fordel ved heparin kolonne rensning er det menes at producere AAV vektorer, som har større infektivitet end produceret dem der bruger en caesiumchlorid gradient 10. Der er dog også nogle ulemper ved denne metode. For eksempel kan andre proteiner, der binder heparin også være til stede i den rensede virus-bestanden. Mens tropisme af heparin-renset vektorer kan være påvirket af vektoren titer 10, vores tilgang til specifikt at målrette enten excitatoriske 20 eller hæmmende neuroner (fig. 2) beskæftiger Cre-induceret aktivering af AAV-medieret transgene udtryk og er titer-uafhængig. Et alternativ til heparin kolonne rensning er brugen af en iodixanol densitetsgradient, som producerer en højere viral titer og renere forberedelse end brugen afen caesiumchlorid gradient 10. Denne metode kan også kombineres med heparin kolonne rensning for at producere en vektor, der er større end 99% ren 11. Derfor omhyggelige overvejelser skal tages af de enkelte grupper, som viral rensning metode er bedst for deres særlige downstream anvendelse.
Det mest almindelige problem forbundet med denne protokol er lavt viral titer. Det er vores erfaring dette kan som regel spores tilbage til lav transfektion effektivitet, eller eluering af virus fra heparin kolonner. Alle transfektion materialer bør have stuetemperatur før transfektion, og test transfections skal udføres for at finde de optimale betingelser i hvert enkelt laboratorium. Andre metoder til transfektion, såsom lipofectamine, er meget effektive, men det kan være uoverkommeligt dyre. Derudover koncentrationen og pH af heparin kolonnen elueringen løsninger er afgørende for komplet eluering af virioner fra heparin kolonner without skader. Et andet vigtigt punkt er, at emballagen celler skal holde godt på overfladen af vævskultur retter. Hvis cellerne løsne sig på et tidspunkt i løbet af proceduren anbefales det at afslutte eksperimentet og afrimning et nyt hætteglas med celler.
Spatio-temporale kontrol af transgene udtryk i gnavere er let opnås ved at præcise anatomiske målrette og udviklingsstadium af dyret. Effektiv AAV-medieret genoverførsel er blevet vist i livmoderen 12,13. I den voksne hjerne, kan området inficeret med rAAV partikler efter stereotaxic injektion justeres fra meget små målrettede regioner, til langt større områder, der ikke kun af ændringer i den virale titer, men også ved at ændre injektion parametre. Disse indbefatter bl.a. mængde og hastighed af injektioner og inddragelsen af polyol mannitol med virussuspension 14. Mannitol kan også bruges til at øge infektion i en række forskellige væv efter systemisk rAAV injektion 15 </ Sup>.
Emballagen kapacitet rAAV (cirka 4,7 kb) er nok den mest begrænsende faktor i forhold til de gener, der kan udtrykkes fra disse virale vektorer. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at dette delvis kan overvindes ved at dele større gener eller udtryk kassetter i separate rAAV vektorer og indføre en bro sekvens, indleder genekspression, når virioner inficere den samme celle 16. Expression niveauer af gener bæres af rAAV vektorer kan også blive øget væsentligt ved hjælp af selv-gratis rAAV vektorer 17. Stereotaxic injektion af rAAV vektorer giver en hurtig, billig og effektiv metode til at fremkalde genekspression i en region-specifik måde. I kombination med 2. generation RNA-interferens strategier 18 rAAVs kan også bruges til region-specifikke gen-knock down. rAAVs kan kombineres med Cre-transgene mus eller celle-typespecifikke initiativtagere at opnå kredsløbs-og celle-type-Specifik genekspression, som gør det genetiske manipulationer med høj rumlig opløsning 2,19-21, mens montering rAAVs med fx Tet-systemet tilføjer tidsmæssig kontrol over virus-medieret genekspression 22,23. Disse eksempler illustrerer den enorme kombinatoriske potentiale i disse vektorer og forudsige en hurtig stigning i rAAV-baserede undersøgelser i løbet af de kommende år.
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol