Rekombinant Adeno-associerade virus (rAAVs) vektorer blir allt mer värdefulla för<em> In vivo</em> Studier på djur. Vi beskriver hur rAAVs kan framställas i laboratoriet och hur dessa vektorer kan titered att ge en korrekt avläsning av antalet smittsamma producerade partiklar.
Under senare år har rekombinant Adeno-associerad virala vektorer (AAV) har blivit allt värdefullt för in vivo-studier på djur, och är också för närvarande testas i kliniska prövningar. Vildtyp AAV är en icke-patogena medlem av parvoviridae familjen och natur replikering-brist. Den breda transduktion profil, lågt immunförsvar, liksom den starka och ihållande transgenen uttryck uppnås med dessa vektorer har gjort dem en populär och mångsidigt verktyg för in vitro och in vivo gen leverans. rAAVs kan enkelt och billigt som produceras i laboratorium och, baserat på deras fördelaktig säkerhetsprofil, är i allmänhet ges en låg säkerhetsklassning. Här beskriver vi en metod för produktion och titering av chimär rAAVs innehåller kapsid proteiner av både AAV1 och AAV2. Användningen av dessa sk chimär vektorer kombinerar fördelarna av båda föräldrarna serotyper som höga titrar lager (AAV1) och reningmed affinitetskromatografi (AAV2). Dessa AAV serotyper är bäst studerade av alla AAV serotyper, och individuellt har en bred smittsamhet mönster. Den chimär vektorer som beskrivs här bör ha infektiösa egenskaper AAV1 och AAV2 och därmed kan förväntas att infektera ett stort utbud av vävnader, inklusive nervceller, skelettmuskel, bukspottkörtel, njure bland annat. Den metod som beskrivs här använder heparin kolumnen rening, trodde en metod för att ge en högre virus titer och renare virus förberedelser än andra reningsmetoder, exempelvis centrifugering genom en cesiumklorid lutning. Dessutom beskriver vi hur dessa vektorer kan snabbt och enkelt titered att ge korrekt avläsning av antalet smittsamma producerade partiklar.
rAAV vektorer blir alltmer värdefulla för in vivo-studier på djur. Här har vi beskrivit en enkel och billig protokoll för att producera rAAVs, som kan underlätta den utbredda tillämpningen av denna nyttiga vektor genom att undvika kostsamma outsourcing av viruset produktion till företag. Det protokoll (baserat på referens 1) beskriver produktionen av chimära rAAV1 / 2 vektorer som innehåller kapsid proteiner från båda föräldrarna serotyper på lika nyckeltal 4. Rening av rAAV vektorer genom att binda till heparin kolumner bygger på uttrycket av AAV2 kapsid proteiner, men kan kombineras med serotyper andra än AAV1 beskrivs här. Dessutom har AAV6 rapporterats att binda till heparin, men med en lägre affinitet, och skulle kunna renas med heparin kolumner med hjälp av denna procedur 5,6. Noteras bör dock att andra serotyper kommer att kräva olika koncentrationer av NaCl för heparin kolumnen eluering 5,7.
Förpackningar rAAV genomen har visat sig vara optimal mellan 4,1 och 4,9 kb med en kraftig minskning av förpackningar verkningsgrad på upp till 5,2 kb 8. Denna förpackning gräns kan anses vara den största nackdelen med den rAAV system, eftersom celltyp reglering av transgenens uttrycket uppnås vanligen med stora cis agerar element som inte kan rymmas inom de små AAV partiklar. För att övervinna låg titer partier, såsom sådana som härrör från att försöka paket gener som ligger nära AAV packning begränsar vi kombinerar olika virus partier koncentrerad till 250 l till ett 500 l parti, snarare än att lägga till PBS som beskrivs i steg 6,3. Pålitlig celltyp specifika transduktion kan uppnås genom att kombinera Cre-driver möss och villkorliga kassetter rAAV (se nedan) för att undvika stretching förpackningen gränsen.
Att notera, medan detta protokoll försöker ge enkla att följa instruktionerna på produktion av hög titer rAAV krävs det närvaro av AAV2 kapsid protein beståndsdelarna för rening av heparin affinitetskromatografi. Serotyper än AAV2 skall renas med hjälp av alternativa förfaranden 9. En fördel med heparin kolumn rening är det tros att producera AAV vektorer som har större smittsamhet takt än som producerats med hjälp av en cesiumklorid lutning 10. Men det finns också vissa nackdelar med denna metod. Till exempel kan andra proteiner som binder heparin också vara närvarande i det renade virala lager. Medan tropism av heparin-renat vektorer kan påverkas av vektorn titer 10, vårt sätt att särskilt inrikta antingen excitatoriska 20 eller hämmande nervceller (Fig. 2) sysselsätter Cre-inducerad aktivering av AAV-medierad transgenens uttryck och är titer-oberoende. Ett alternativ till heparin kolumnen rening är att använda en iodixanol densitetsgradient, vilket ger en högre virus titer och renare förberedelser än användning aven cesiumklorid lutning 10. Denna metod kan också kombineras med heparin kolumnen rening för att producera en vektor som är större än 99% ren 11. Därför måste övervägas noga som ska vidtas av enskilda grupper om vilka virus rening metod är bäst för just deras nedströms ansökan.
Det vanligaste problemet i samband med detta protokoll är låg virus-titer. Enligt vår erfarenhet här kan vanligtvis spåras till låga transfektion effektivitet, eller eluering av virus från heparin kolumner. Alla transfektion material ska i rumstemperatur innan transfektion, och testa transfections bör utföras för att hitta de optimala förhållandena i varje laboratorium. Andra metoder för transfektion, såsom lipofectamine, är mycket effektiva, men kan vara oöverkomligt dyr. Dessutom är koncentrationen och pH-värdet i heparinlösningar kolumnen eluering kritiskt för komplett eluering av virioner från heparin kolumner withoUT skador. En annan viktig punkt är att förpackningen cellerna måste följa väl till ytan på disken vävnadsodling. Om cellerna loss vid något tillfälle under förfarandet är det tillrådligt att avsluta försöket och tina en ny flaska av celler.
Tid och rum styrning av transgenen uttryck hos gnagare är lätt uppnås genom korrekt anatomisk inriktning och utvecklingsstadiet av djuret. Effektiv AAV-medierad genöverföring har visats i livmodern 12,13. I den vuxna hjärnan, kan det område som är smittat med rAAV partiklar efter stereotaxic injektion justeras från mycket små utvalda regioner, till mycket större områden inte bara av förändringar i det virala titer, men också genom att ändra injektion parametrar. Dessa inkluderar volym och hastighet injektioner och införlivandet av polyol mannitol med virussuspension 14. Mannitol kan också användas för att förbättra infektion i olika vävnader efter systemisk rAAV injektion 15 </ Sup>.
Förpackningen kapacitet rAAV (ca 4,7 kb) är förmodligen den mest begränsande faktorn i termer av gener som kan uttryckas från dessa virala vektorer. Dock har nya studier visat att detta delvis kan övervinnas genom att dela upp större gener eller kassetter uttryck i separata rAAV vektorer och införa ett överbryggande sekvens, initiera genexpression när virioner infekterar samma cell 16. Uttryck nivåer av gener som bärs av rAAV vektorer kan också förbättras avsevärt genom att använda egen gratis rAAV vektorer 17. Stereotaxic injektion av rAAV vektorer ger en snabb, billig och kraftfull metod för att inducera genuttryck i en region-specifika sätt. I kombination med två RNA andra generationens interferens strategier 18 rAAVs kan också användas för region-specifika gener slå ner. rAAVs kan kombineras med Cre-transgena möss eller celltyp specifika projektansvariga att åstadkomma krets-och cell-typ-Specifik genuttryck, som möjliggör genetiska manipulationer med hög rumslig upplösning 2,19-21, medan montering rAAVs med t.ex. Tet Systemet lägger tidsmässiga kontroll över virus-medierad genuttryck 22,23. Dessa exempel visar den enorma combinatorial potentialen hos dessa vektorer och förutspår en snabb ökning av rAAV-baserade studier under de kommande åren.
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol