En compartmentalizing microfluidic enhet for etterforskning kreft stamceller migrasjon er beskrevet. Denne romanen plattform skapes en levedyktig mobilnettet mikromiljøet og gjør mikroskopisk visualisering av levende celle bevegelse. Svært bevegelige kreftceller er isolert for å studere molekylære mekanismer for aggressiv infiltrasjon, potensielt fører til mer effektive fremtidige terapier.
I de siste 40 årene, investert USA over 200 milliarder dollar på kreftforskning, noe som resulterer i bare 5% reduksjon i dødelighet. Et stort hinder for å forbedre pasientens utfall er dårlig forståelse av mekanismene bak mobilnettet migrasjon assosiert med aggressiv kreft celle invasjon, metastasering og terapeutisk motstand 1. Glioblastoma multiforme (GBM), den mest utbredte primære ondartet voksen hjernesvulst to, eksemplifiserer dette problemet. Til tross for standard kirurgi, stråling og kjemoterapi, er pasienten median overlevelse bare femten måneder, på grunn av aggressiv GBM infiltrasjon i tilstøtende hjernen og rask kreft tilbakefall to. Interaksjonene mellom avvikende celle trekkende mekanismer og svulsten mikromiljøet sannsynlig skille kreft fra normale celler tre. Derfor, bedre terapeutiske tilnærminger for GBM krever en bedre forståelse av kreft celle migrasjon mekanismer. Nyere arbeid antyder thata små subpopulasjon av celler i GBM kan hjernesvulst stamcelle (BTSC), være ansvarlig for terapeutisk motstand og tilbakefall. Mekanismene bak BTSC vandrende kapasitet er bare begynner å bli preget 1,4.
På grunn av en begrensning i visuell inspeksjon og geometriske manipulasjon, konvensjonelle migrasjon analyser 5 er begrenset til tallfesting samlede cellepopulasjoner. I kontrast, microfluidic enheter tillate enkelt celle analyse på grunn av kompatibilitet med moderne mikroskopi og kontroll over mikro-miljøet 6-9.
Vi presenterer en metode for detaljert karakterisering av BTSC migrasjon hjelp compartmentalizing microfluidic enheter. Disse PDMS-laget enheter kastet vevet kultur miljø i tre tilkoblede avdelinger: seeding kammer, kammer og bygge bro microchannels. Vi skreddersydd enheten slik at begge kamre har nok media til å støtte levedyktige BTSC for 4-5 days uten media utveksling. Svært mobile BTSCs utgangspunktet introdusert i seeding kammeret er isolert etter overføringen skjønt bygge bro microchannels til parallell kammer. Dette migrasjon simulerer kreft cellular spredning gjennom mellomrommene i hjernen. Fase levende bilder av cellemorfologi under trekket er registrert over flere dager. Langtmigrerende BTSC kan derfor være isolert, recultured, og analyseres videre.
Compartmentalizing MicroFluidics kan være en allsidig plattform for å studere trekkadferden av BTSCs og andre kreft stamceller. Ved å kombinere gradient generatorer, fluidbehandlende, mikro-elektroder og andre microfluidic moduler, kan disse enhetene også brukes for narkotika screening og sykdom diagnose 6. Isolering av en aggressiv undergruppe av trekkende cellene vil muliggjøre studier av underliggende molekylære mekanismer.
Microfluidic enheten og bilde-opptak teknikk presenteres her gjør en visuell karakterisering av mobilnettet morfologi under trekket. Sammenlignet med eksisterende konvensjonelle metoder, har microfluidic plattformen fordeler av kostnadseffektivitet, høy gjennomstrømming og design fleksibilitet. Den presenterte mikroskopiske visualisering system tillater studier og opptak av langsiktige live celle migrasjon. Linsen-motorisert funksjonen gjør det mulig å spore flere migrasjonsveier i en høy bilde-oppløsning uten å forstyrre prøven.
Under montering av enheten, er PDMS stempel ikke-permanent limt til glasset dekkglass for bekvemmeligheten av PDL belegg (trinn 3.4). Det er avgjørende for å oppnå en god forsegling for å lykkes med denne protokollen. Forurensning innført fra enheten fabrikasjon, slik som luft boble i stempel eller støv / rusk på substratet, kan det utsette liming og resultere i væske lekker. Derfor treating enheten i et støvfritt måte er viktig for å forebygge feil med enheten. Før PDL-belegg, glass dekkglass er salpetersyre behandles og PDL oppløsningen sentrifugert for å fjerne støv / rusk. Vi finner Scotch tape, alkohol skyll og vannbad svært nyttig i å fjerne støv / rusk fra PDMS stempel, hvis et rent rom er ikke tilgjengelig. Etter PDMS stempel å ta kontakt med dekkglass, trykke stempelet forsiktig med pinsett forenkler forseglingen.
BTSCs kan bli beriket fra menneskelige operasjonssykepleiere prøver via sfære kultur i stamcelleforskningen medium, lik kultur normale nevrale stamceller 10. BTSCs beriket på denne måten demonstrere stamcelle-lignende egenskaper, for eksempel uttrykk for stamcelleforskningen markører (CD133, nestin), differensiering til flere nevrale linjene (glial og neuronal), og startfasen i en orthotopic immunsupprimert mus modell med så få som 100 celler 18. Selv om noen debatt finnes om renseteknologining og vedlikehold av en BTSCs, 19-21, sfære vokst BTSCs bedre opprettholde fenotype og genotype av foreldrepermisjonen svulst 22-24.
Den compartmentalized plass etterligner den fysiologiske miljø for celle migrasjon. I enheten vår, BTSC viser en sterk evne til migrasjon gjennom en størrelse begrenset plass ved å regulere cellulære morfologi. Vår karakterisering av cellen morfologiske endringer indikerer modus-transformasjoner i en seks trinns sekvens som kan modellere en mulig ny detaljert beskrivelse av BTSC invasjon av tilstøtende hjernen. I tidlige stadier, cellene får en betydelig mengde av polaritet og generere lim fremspring å effektivt forankre seg inne i microchannel. Når cellen belegg i microchannel er etablert, konverterer den til en cruising modus og opprettholder denne modusen for hele reisen gjennom et microchannel. På dette stadiet, BTSC opprettholde høy motilitet og konsekvent retning, men spare energi. Iterestingly, ser det ut til at en microchannel er begrenset til én cruising celle om gangen, slik at når en enkelt celle fortsetter til dette stadiet, andre celler retrett fra microchannel. Denne mekanismen sikrer trolig effektiviteten av tumor spredning og hindrer overforbruk av næringsstoffer i microchannel. Etter endt migrasjon over microchannel, gjenvinner en celle sin tilbøyelighet for allsidig fremspring og videre leting etter invasjonen mål eller nye migrasjonsveier. Den compartmentalizing microfluidic enheten tilbyr en roman in vitro betyr å skape en mikromiljøet for å studere BTSC infiltrasjon av hjernen parenchyma.
Denne metoden kan lett tilpasses til studiet av kreft stamcelle (CSC) og trekkende cellelinjer avledet fra andre tumortyper. Dyrkning celler i microfluidic enheten kan utføres i en hvilken som helst moderne biologi laboratorium som er utstyrt med en inkubator og vevskultur kompetanse. Utstyrt med en su-8 master, PDMScasting og enheten montering er mulig med noen grunnleggende opplæring i myk litografi. I tillegg kan denne plattformen også utvides for andre applikasjoner med integrere andre funksjonelle moduler som gradient mikser, overflate mønster, væskekontroll og mikroelektroden.
The authors have nothing to disclose.
PAC er delvis støttet av en NIH T32 tilskudd til University of Wisconsin Stem Cell Training Program (PA Clark). JSK ble delvis støttet av Headrush hjernesvulst Forskning Professorat, Roger Loff Memorial GBM forskningsfond, og UW Foundation / nevrokirurgi hjernesvulst forskning og utdanning Fund. JCW og YH er delvis støttet av NIH stipend NIBIB 1R01EB009103-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | Gibco / Invitrogen | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Ham’s F12 | Gibco / Invitrogen | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
B27 supplement minus vitamin A | Gibco / Invitrogen | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Antibiotic-Antimycotic (PSA) | Gibco / Invitrogen | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Laminin (natural mouse) | Gibco / Invitrogen | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Accutase | Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Stem cell medium |
|
||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
|
||
Epidermal Growth Factor (EGF) |
|
||
Heparin |
|
||
su-8 photoresist | MicroChem | ||
Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
laminin | BD Bioscience | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
Biostation IM | Nikon instruments |