Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

1. BTSC cellule de dissociation BTSCs proviennent préexistantes cultures cultivées dans un milieu sans sérum de cellules souches tel neurosphères. culture dont on décrit précédemment 10, 11. Préparer une suspension cellulaire à partir BTSC dérivés neurosphères. BTSC neurosphères dérivées sont recueillies dans un tube conique de 15 ml et centrifugé à 900 tours par minute pendant 5 minutes. Plus rapide centrifugation peut cisaillement et / ou d'endommager l'neurosphères. Surnageant est aspiré et la culture de neurosphères est remis en suspension dans 0,5 ml de pré-chauffé Accutase. Cette solution est incubée pendant 5-10 minutes à 37 ° C permet de desserrer les neurosphères. Les cellules sont mécaniquement désagrégé avec 10-20 caresses d'une pipette P100, puis 1,5 ml de milieu de cellules souches est ajouté aux cellules pour neutraliser la Accutase. Les BTSCs sont ensuite centrifugés à 1300 rpm pendant 5 minutes, et remis en suspension dans 1 ml de milieu de cellules souches. Une aliquote de 50 ul est retiré des suspension et placé dans un microtube pour le comptage des cellules. 50 l de bleu trypan est ajouté au tube Eppendorf et la suspension est placée dans un hémocytomètre pour le comptage des cellules. Si nécessaire, après le comptage des cellules, les cellules souches moyen supplémentaire est ajouté à la suspension BTSC pour donner une densité cellulaire de 20.000 cellules vivantes / ul médias. 2. Fabrication de bi-couches su-8 maître et le moulage de PDMS timbre (voir figure 1) Nous utilisons la lithographie optique et la lithographie douce pour la fabrication de SU-8 maître et PDMS timbre, qui sont essentielles pour le montage des dispositifs microfluidiques. Légèrement différent de la procédure standard de 12, notre maître su-8 est composé de deux couches. Les microcanaux 3-um-hauts sont coulés dans la première couche / bas plus tôt dans le processus, alors que les chambres 250-um-hauteur d'ensemencement et de réception sont dans la deuxième couche / supérieur. Pour une connexion correcte entre les deux compartiments de la culture (microcanauxs et chambres), les deux couches doivent être alignées avec précision en position. Cependant, l'épaisseur et l'opacité de la deuxième couche sont assez grands pour bloquer l'alignement fiducial / optique d'accéder aux caractéristiques du fond. Ici, nous concevons des masques avec des marqueurs fiduciaires étant positionné à distance. Ainsi, ces marqueurs dans la première couche peut être sélectivement blindé tout en faisant tourner la seconde couche. En conséquence, les deux couches de fonctionnalités sont réalisés en une seule maître et prêt pour le moulage en bas-relief du timbre en PDMS. Concevoir et préparer deux photo-masques. Un masque constitué de deux marqueurs de référence et un réseau de micro-canaux (400 m de long et 10-50 um de large) de la première couche. Un autre masque est constitué de chambres de réception de l'ensemencement et (2 mm de long et 600 um de large) de la deuxième couche. Les deux masques sont conçus dans Illustrator (Adobe, Californie), imprimée au laser sur films transparents (Pièces métalliques minces, Colorado), nettoyés avec de l'isopropanol et séché à l'air. Faire la première couche avecsu-8 photosensible (MicroChem, Massachusetts) selon le manuel produit auprès du fournisseur. Tout d'abord, la couche de spin-plaquette de manipulation (WRS matériaux, Californie) avec du 3-um d'épaisseur de résine photosensible SU-8 (5), suivie de la cuisson douce. La résine photosensible est ensuite exposée aux ultraviolets et durci avec le masque correspondant en gros de contact, suivie de post-cuisson et en développement. Spin-couche de la seconde couche de 250 um d'épaisseur SU-8 (2100). Afin d'éviter de photorésist épais de blocage des marqueurs de référence de la première couche, on couvrir ces zones avec du scotch en avant centrifugation de la seconde couche. La bande est ensuite enlevée pour révéler les marqueurs à des fins d'alignement. UV-exposer la seconde couche avec le deuxième masque. Avec les repères d'alignement a révélé, il est facile de les aligner sur ceux du second masque à l'aide d'alignement de masque optique. La deuxième couche de résine photosensible est ensuite exposée aux ultraviolets et durci en gros de contact, suivie de post-cuisson et en développement. </ Li> Anti-adhérent manteau du maître abouti. À aider au retrait du PDMS durci, le maître SU-8 peut être silanisée par dépôt en phase vapeur pour rendre la surface d'un revêtement anti-adhérent de type. Il suffit de le placer dans un dessiccateur pendant au moins une heure, avec quelques gouttes d'trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) solution de silane sous vide. Mouler PDMS avec le maître. Mélanger la base de prépolymère et guérisseur de PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) en fond de 10:1. Placez-le dans un dessiccateur de dégazage sous vide jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air est visible. Verser le mélange sur le masque et dégazer de nouveau si une nouvelle bulle d'air est introduit. Guérir le moule sur une plaque chauffante niveau pendant 2 heures à 90 ° C. Après refroidissement à température ambiante, relâchez doucement le timbre en PDMS. Ainsi, les chaînes de culture sont gravés dans PDMS et prêt pour l'assemblage de l'appareil. Le maître est réutilisable pour le moulage jusqu'à ce qu'il est fissuré ou usé. Le revêtement anti-adhésif doit être exécutée à nouveau lorsque la viscosité reprend. 3.Assemblée des dispositifs microfluidiques et de culture cellulaire (figure 2) Pour des cellules en culture, dispositif-tampon gravé PDMS est fixée à une lamelle de verre pour former des canaux fermés. Entrées et les sorties sont créés pour le chargement de la culture / médias. Pendant ce temps, le nettoyage et d'autres procédures sur le substrat de verre et tampon de PDMS sont nécessaires pour assurer la cellule-compatibilité. Assurez-réservoirs à travers le tampon de PDMS en utilisant perforatrice biopsie. Nous avons choisi d'être leur diamètre 6 mm. Ces réservoirs servent à deux fins. La première consiste à tenir des nutriments supplémentaires pour la croissance cellulaire. L'autre est pour l'accès de chargement pipette et l'aspiration. Faire tremper le tampon de PDMS dans 70% d'éthanol pendant 30 minutes, puis rincez avec de l'eau désionisée pendant 10 min. Le but est de dégager potentiels résidus organiques introduites au cours du processus de fabrication, et non réticulé contamination PDMS. Procédés de nettoyage plus intenses et plus approfondie, comme l'extraction organique 13 </sup> Et l'extraction Soxhlet 14 ont été utilisés ailleurs. Cependant, nous avons constaté qu'il n'était pas nécessaire dans la culture BTSC. Stériliser le timbre de PDMS en utilisant autoclave (121 ° C, 35 min). Cette étape achève la réaction de réticulation plus de PDMS. A partir de cette étape et jusqu'à l'étape 3.6, toutes les procédures sont prises de manière stérile. Le timbre de PDMS est ensuite posé sur une lamelle de verre, préalablement recouvertes de poly-L-lysine. 15-17 Le dispositif est ensuite revêtue de laminine en remplissant le canal avec la laminine solution pendant une nuit à 37 ° C. Laminine est aspiré à partir de l'appareil et l'appareil est lavé avec du milieu de cellules souches. Chargez suspension cellulaire de l'étape 1 dans des réservoirs et des canaux. 11 pl de cellules dissociées sont placés dans un réservoir de semence. Aspiration sous vide est utilisée pour forcer les cellules dans la chambre d'ensemencement, si nécessaire. Un montant supplémentaire de 7 pi de cellules sont placées le réservoir attenant ensemencement. Remarque: la densité cellulaire moyenne est de 20.000 cellules / ul médias. À l'arrièreer cinq minutes, l'ensemencement et les réservoirs de réception sont inondées avec les médias. Placez un 0,5-1 mm pré-stérilisé à l'autoclave feuille de PDMS sur le dessus. L'adhérence à la surface naturelle s'est produite entre deux morceaux de PDMS fera de la culture cellulaire étanche et prêt pour le transport, l'incubation et l'imagerie microscopique. 4. À long terme imagerie time-lapse de la migration BTSC avec BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, Etats-Unis). La combinaison de caméra, le logiciel et l'incubateur dans une seule boîte, ce système microscopique permet à la culture de cellules d'image sans perturbation pendant des jours. En outre, sa conception unique du moteur déplace la lentille de l'objectif et maintient étape d'échantillonnage fixe dans la fonction de point de visite. Il est donc pratique pour les expériences d'image parallèles et la locomotion cellulaire piste à haut débit de dosage. Pré-équilibrer l'IM Biostation pendant 45 minutes pour stabiliser l'alimentation en température, d'humidité et de l'air. L'addition d'eau-cont plusieursplats ained en chambre d'échantillon est utilisé pour maintenir une humidité adéquate. Chargez l'appareil cellulaire contenu dans la chambre échantillon de microscope, et le centre à l'aide des pinces micro. Réglez l'orientation, la position des points et du temps-points dans le logiciel Biostation et démarrer le time-lapse. 5. Les résultats représentatifs: Des exemples de l'inspection visuelle et la caractérisation de la migration des cellules cancéreuses en utilisant un dispositif microfluidique cloisonnement sont illustrés dans la Figure 3 et Figure 4. La lignée cellulaire est BTSC. Avec notre configuration actuelle, images de phase de culture cellulaire peuvent être enregistrées en continu aussi longtemps que 5 jours (Figure 3) et aussi fréquemment que toutes les 2 secondes (Figure 4). Au-delà de 5 jours, les milieux de culture doivent être remplacés pour la reconstitution des éléments nutritifs et les déchets enlevés. À long terme, time-lapse identifie une séquence tournante de six stades cellulaires au cours de sa migration sur la base des changements morphologiques. Comme illustré à la figure 3, nous les décrivent comme (i) de pré-migration, (ii) l'initiation, (iii) de chemin d'exploration, (iv) de croisière, (v) de destination exloration et (vi) de post-migration. Dans la chambre de réception, en forme de fuseau cellules restent dans l'étape (i) en vrac dans des tumeurs qui sont capables de se développer, diviser et migrer progressivement. À l'approche de l'entrée de microcanaux, quelques cellules procéder à l'étape (ii) quand ils se développer et générer saillie adhésif. Seulement une d'entre elles est susceptible d'occuper l'entrée et passer à l'étape (iii), qui peut explorer la direction de migration. Une fois la cellule détermine la direction de migration, il passe à l'étape (iv) pour une croisière à travers le microcanal à une vitesse constante et élevée, ce qui se fait à travers le microcanal entier. À la fin de microcanaux, produit des cellules à l'étape (v) pour explorer l'espace ouvert de la chambre de réception, puis à l'étape (vi). En microcanal, la puissance migration est principalement généré par l'activité blebbing comme illustré à la figure 4, similaire à celle de amiboïde cell. Bourgeonnement cellulaire et déformation de la membrane sont entièrement enregistrée ici. Figure 1. Schéma de fabrication de dispositif microfluidique. L'ensemble du processus est réalisée sur une tranche de silicium 3-pouces poignée grâce à une technique de lithographie douce modifiée. 3-um-haut microcanaux et les marqueurs d'alignement sont réalisés comme dans la première couche. Puis 250-pm d'épaisseur SU-8 est appliquée par centrifugation, tandis que les repères d'alignement sont recouverts de ruban adhésif, de telle sorte qu'elles peuvent ultérieurement être accessible pour masquer aligneur sans blocage de la vue par photorésist épais. Ainsi, les caractéristiques de la chambre ne peut se faire que la seconde couche alignés avec précision et à la première couche. Timbre PDMS est finalement moulé hors le maître qui en résulte. Figure 2. Schéma d'ensemble du dispositif et le processus de l'ensemencement des cellules. Enfermée dans PDMS et gllamelle âne, l'espace de culture 3D est composé de chambres, des réservoirs et des microcanaux. La chambre est remplie d'ensemencement de culture de cellules, tandis que la chambre de réception est initialement rempli d'un milieu sans cellule. Les microcanaux qui relient entre eux fournissent piste cellules migrent d'un côté semis à côté de la réception. Figure 3. BTSC la migration à travers microcanal. Supérieur: des instantanés de time-lapse montrer une seule cellule (surligné en vert) migre plus de 400 um de côté ensemencement sur le côté de réception. Le voyage entier prend environ 2 jours, impliquant une séquence de changements morphologiques cellulaires. La barre d'échelle est de 40 um. Abaissez: une représentation dessinée de six étapes de migration. Pré-migration (i): Dans la chambre d'ensemencement, les cellules en forme de fuseau et divisible migrer progressivement le long de l'autre. Les cellules proches de l'entrée de microcanaux course à l'autre par polarisation corps cellulaire et e xerting saillie lamellipodes. Initiation (ii): La cellule migratoire avec la plus grande capacité occupe l'entrée du canal tandis que ses concurrents vont battre en retraite. Chemin d'exploration (iii): Les modifications des cellules migratoires vers un mode de polarité peu amiboïdes. Ce mode de migration est extrêmement mobiles et capables d'explorer chemin dans toutes les directions par blebbing petites protrusions membranaires. Croisière (iv): Une fois le chemin de migration est déterminée, la cellule se transforme en un mode amiboïde adapté par le maintien d'une saillie supplémentaire importante rubrique de l'avant. Ainsi, la cellule maintient une grande mobilité et une direction constante et la vitesse. Destination d'exploration (v): À la fin de parcours, la cellule ralentit et se développe filopodias d'explorer la chambre de réception pour toute cible invasion. Post-migration (vi): Après être entré dans la chambre de réception, la cellule se transforme en forme d'étoile et conserve la motilité élevée, mais pas de direction déterminée. "/> . Figure 4 Instantanés de time-lapse montrer le cycle de déformation blebbing activité et de la membrane d'un BTSC: (AB). initiation; (BD). Extension; (DF). Rétraction. Les flèches et les lignes courbes représentent la direction et l'emplacement de déformation de la membrane, respectivement. Les instantanés sont collectées toutes les 8 secondes.