Summary

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

Published: October 07, 2011
doi:

Summary

Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.

Abstract

O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue 1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os 1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 – isolectin B 4) injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima 3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração 60-10.

Protocol

1. Fluoresceína rotulados dextran e GSL I-isolectin B 4 injeções veia facial para rotular vasculatura embrionárias Prepare FITC-dextran (50ug/mL) em tampão fosfato salino (PBS) ou GSL 1 – isolectin B 4 (20ug/200uL) em PBS em um tubo Eppendorf 1,5 ml e aquecer a 37 ° C. Adicionar 100uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS para a solução FITC-dextran (volume total de 1ml) e 180uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS a um GSL – isolectin B 4 (200uL volume total), de modo qu…

Discussion

Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso,…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por números conceder R01AI055001 e R01AI082127 de NIAID a NRM e Award Fellowship SREB Dissertação de JLB.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 Vector Laboratories FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. VWR 25608-930
Acetone JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rat anti-mouse CD31, BD Pharmingen 558736
goat anti-mouse PDGFR-β R&D Systems AF1042
donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Low melt agarose/PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Methanol Fisher Scientific A413-4
Benzyl Alcohol Acros Scientific 148390010
Benzyl Benzoate Acros Scientific 105860010
Depression slides Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Cover Glass (22X22)-1.5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss  
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135
Parafilm No. OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 and 24 well microplates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
4mL clear vials National Scientific B7800-2

Referencias

  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
  3. Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
  4. Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
  5. Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
  6. Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
  7. Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
  8. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  9. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  10. Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).

Play Video

Citar este artículo
Bryson, J. L., Coles, M. C., Manley, N. R. A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice. J. Vis. Exp. (56), e3267, doi:10.3791/3267 (2011).

View Video