Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Die hier beschriebene Methode wurde in der folgenden Publikation verwendet: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 Zellkultur Materialien: fötales Rinderserum (FBS), Huhn Serum, Penicillin / Streptomycin, 2-Mercaptoethanol, RPMI Bereiten Zellkulturmedium: add 7% FBS, 3% Hühnerserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 10 uM 2-Mercaptoethanol in RPMI Medium. DT40 Zellen werden in sterile Zellkulturflaschen bei 38 ° C gezüchtet und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Split-Zellen jeden Tag bis zu einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen / ml 6. 2. In-vivo-Markierung Materialien: IdU, CldU Stammlösungen von Nukleotid-Analoga: Man löst IdU bis 5 mm und CldU bis 2,5 mM in Medium. Hitze beide Lösungen kurz auf 60 ° C und vortexen, bis die NukleotidanalogDie Werte sind völlig aufgelöst. Add IdU bis zu einer Endkonzentration von 25 uM bis exponentiell wachsenden DT40 Zellen und mischen die Zellsuspension gut. Inkubieren Zellen für 20 Minuten bei 38 ° C und 5% CO 2. Nach der Inkubation mit dem ersten Etikett, fügen CldU bis zu einer Endkonzentration von 250 uM und behandeln Zellen als in den vorherigen Schritt beschrieben. Wash-Zellen mit eiskaltem PBS resuspendieren und sie in einer Konzentration von 7,5 x 10 5 Zellen / ml in kaltem PBS. Halten Sie die markierten Zellen auf Eis. Die Kennzeichnung beschriebene Verfahren ist nur ein Vorschlag und kann modifiziert werden, um spezifische Fragen zu beantworten sein. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Informationen auf experimentelles Design. 3. Zell-Lyse und DNA Verbreitung Material: Glas Dias, Faser-Lyse-Lösung Bereiten Sie die Faser Lyse-Lösung: 50 mM EDTA und 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 <li> Spot 2 ul der Zellsuspension zu einem Ende der Glasplatte. Air-Dry für 5 Minuten oder bis das Volumen des Tropfens ist stark reduziert, aber nicht trocken. Pipettieren 7 ul Lyse-Lösung auf der Zellsuspension und vorsichtig mit der Pipettenspitze auf die Lösungen zu mischen rühren. Inkubieren für 2 Minuten für die Zell-Lyse, um fortzufahren. Tilt Dias bis 15 °, damit die Fasern entlang der Folie verteilen. Sobald die Faser-Lösung der Unterseite der Folie erreicht hat, legen Sie sie horizontal an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen sollte eine dünne, opake Linie sichtbar entlang der Folie. An dieser Stelle sollte der Beginn der gestreckten Fasern mit einem Bleistift als nach dem Färben wird die Linie nicht mehr sichtbar gekennzeichnet sein. Dieses Zeichen wird später helfen, die Fasern unter dem Mikroskop zu finden. 4. Immunfluoreszenzfärbung Materialien: Methanol, Essigsäure, HCl, 5% BSA in PBS, Küvette, anti-BrdU (Maus)-Antikörper,anti-BrdU (Ratte)-Antikörper, Schaf-anti-Maus-Cy3 Antikörper, Ziege-anti-Ratte Alexa Fluor 488 Antikörper, Vectashield Eindeckmedium, Deckgläser, Nagellack Tauchen Sie gleitet in Methanol / Essigsäure (3:1) in einer Küvette und inkubieren für 10 Minuten. Waschen Sie die Objektträger in destilliertem H 2 O, dann tauchen in 2,5 M HCl für 80 Minuten. Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten. Die Objektträger aus der Küvette und sammeln überschüssige PBS mit einem Papiertuch. Setzen Sie die Dias horizontal und Pipette 5% BSA übereinander gleiten. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Deckglas auf die BSA gleichmäßig über die Folie und inkubieren für 20 Minuten. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:25 anti-BrdU (Maus) und 1:400 anti-BrdU (Ratte). Bewegen Sie das Deckglas vorsichtig ins Glas Folie, um sie zu entfernen. Bitte keine Gewalt anwenden, wenn das Deckglas klebt an der Folie. Die Folie kann in PBS rehydriert werden, bis das Deckglas wird locker eind kann leicht entfernt werden. Sammeln Sie überschüssige BSA mit einem Papiertuch und Objektträger horizontal. Pipet 50 ul der Primärantikörper-Lösung auf jeder Folie. Deckel wieder mit einem Deckglas auf die Antikörper-Lösung gleichmäßig über die Folie und inkubieren in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:500 Schaf Anti-Maus-Cy3 und 1:400 Ziegen-anti-Ratte Alexa Fluor 488. Übernehmen 50 ul der sekundären Antikörper-Lösung als für den primären Antikörper beschrieben. Schützen Sie die Folien aus Licht und Inkubation für 1 Stunde. Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten. Fügen Sie einen Tropfen Vectashield Eindeckmedium auf jeder Folie auftragen und Deckglas. Drücken Sie vorsichtig die Deckgläser und die überschüssige Flüssigkeit entfernt um sie mit einem Papiertuch. Seal Deckgläser mit transparenten Nagel polish und trocknen lassen. Bewahren Sie die Objektträger bei -20 ° C. 5. Bildaufnahme Materialien: Fluoreszenz-Mikroskop, Kamera Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf eine Folie in der Nähe der Bleistift und starten Auffinden der Fasern. In der Regel gibt es eine Haupt-Faserbündel, aber diese Fasern sind zu verstrickt und kann später nicht mehr analysiert werden. Entfernen Sie sich von der Haupt-Bundle zu Bereichen, in denen Fasern deutlich voneinander (Abb. 2) sind getrennt zu finden. Wir würden uns wählen Bilder nur mit einem Farbkanal, um Verzerrungen zu vermeiden. Dann würden wir etwa 10 Bilder von jedem Zeitpunkt, Konzentrations-oder Zell-Linie. Allerdings hängt die Anzahl der Bilder auf, wie viele Fasern können auf jedes Bild gezählt werden. Bewegen Sie sich entlang der Folie, um die verschiedenen Bilder zu machen, wenn ein Bereich einer Folie nicht liefern können Vertreter Faserlängen oder Replikation Strukturen. 6. Datenanalyse <p class="Jove_content"> Materialien: Picture-Analyse-Programm, z. B. ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) Importieren von Bildern in ein Bild-Analyse-Programm. Messen Sie die Länge der Nervenbahnen und / oder die Anzahl der verschiedenen Replikations-Strukturen (Abb. 3). Nur zählen Fasern, die deutlich sichtbar und welche nicht über den Rand des Bildes zu erweitern sind. Wir messen typischerweise die Länge von etwa 100 Fasern und zählen 150-200 Replikation Strukturen und wir würden wiederholen einzelnen Versuchen mindestens dreimal. 7. Repräsentative Ergebnisse: Neu replizierte DNA kann als Linien von Antikörper-markierten Nukleotid-Analoga visualisiert werden. In unseren Experimenten eine laufende Gabel ist neben roten und grünen Signale (Abb. 3) dargestellt. Die doppelte Kennzeichnung Protokoll erlaubt uns auch, vier große Klassen von Replikation Strukturen zu definieren: 1) neue Einleitung Ereignisse können divid werden ed in Herkunft, die ausgelöst werden, während die Zellen mit dem ersten Label und Herkunft, die während der Inkubation mit dem zweiten Label gefeuert haben inkubiert haben. Erstere bestehen aus benachbarten Grün-Rot-Grün-Signale und die letztere von einer grünen Linie. 2) Kündigung Ereignisse manifestieren sich als angrenzende rot-grün-roten Signalen. 3) durchsetzt Ursprünge sind Stellen im Genom mit eng beieinander liegenden Ursprünge. Solche Seiten bestehen aus aufeinander Herkunft und Stopp-Signale. 4) je nach experimentellem Design, gekippt / zusammengebrochen Gabeln kann entweder als nur rot-Signal 7 oder eine rote Linie durch einen kurzen grünen Trakt 8,9 gefolgt definiert werden. Mit den hier beschriebenen Bedingungen, Wildtyp DT40 Zellen haben eine durchschnittliche Gabel Geschwindigkeit von 0,4 mu m / min. Wir können erkennen, etwa 63% laufenden Gabeln, 10% Herkunft, 16% ins Stocken geraten Gabeln (red nur Flächen), 8% Kündigungen und 3% durchsetzt Fasern. Abbildung 1 "/> . Abbildung 1 (A) Die linke Seite der Karikatur zeigt den ersten Schritt der DNA-Markierung vor: Zugabe IdU exponentiell wachsenden DT40 Zellen führt das Nukleotid-Analogon zu leicht in die neu synthetisierten und nacheilenden DNA-Stränge eingebaut werden. Dies kann durch Verwendung eines spezifischen Antikörpers sichtbar gemacht werden, und wird als eine rote Linie angezeigt, wenn unter dem Mikroskop betrachtet. Anschließend wird die gleiche Prozedur mit CldU wiederholt auf der rechten Seite der Abbildung dargestellt. Nach der Inkubation mit dem zweiten Nukleotid-Analogon, wird eine aktive Gabel sichtbar sein als eine angrenzende Rot-Grün-Darm-Trakt. Die durchschnittliche Faserlänge ist proportional zur Inkubationszeit der Nukleotid-Analoga. (B) DNA aus lysierten DT40 Zellen wird durch die Schwerkraft auf einen Objektträger gestreckt und die inkorporierte Nukleotid-Analoga werden visualisiert durch die Verwendung von spezifischen Antikörpern und Fluoreszenzmikroskopie. BBILDUNG 2 "/> Abbildung 2. Ein Vertreter Fluoreszenzbild zeigt Fasern, die aus Wildtyp DT40 Zellen anschließend mit IdU und CldU für jeweils 20 Minuten markiert. Die meisten Fasern sind gut voneinander getrennt und können somit leicht analysiert werden. Der weiße Balken repräsentiert 10 pm. . Abbildung 3 Die Doppel-Kennzeichnung Faser Technik erlaubt es, zwischen verschiedenen Replikation Strukturen zu unterscheiden; 1 – aktiv repliziert Gabeln, 2 – neue Standorte der DNA-Replikation (Abfeuern von neuen Wurzeln), 3 – Gabel Kündigungen (zwei konvergierenden Gabeln), 4 – durchsetzt Fasern (Seiten von eng beieinander liegenden Ursprünge) und 5 – ins Stocken geraten Gabeln (nur rot-Signal).