Summary

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

Published: December 17, 2011
doi:

Summary

М клеток в специализированные фолликула связанных эпителия покрытие Пейеровы бляшки играют важную роль для слизистой иммунологического в кишечнике-лимфоидной ткани. Здесь мы описали метод оценки бактериального трансцитоза клетками М<em> В естественных условиях</em>. Этот метод предоставляет способ понять М-клеток в иммунной системе.

Abstract

Внутри нашего кишечнике обитает огромное количество синантропных бактерий. Поверхности слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта постоянно подвергаются им, а иногда и к патогенам. Кишкой лимфоидной ткани (GALT) играют ключевую роль для индукции иммунного ответа слизистой оболочки к этим микробам 1, 2. Чтобы инициировать иммунный ответ слизистой оболочки, слизистой оболочки антигены должны быть перевезены из просвета кишечника через эпителиальный барьер в организованных лимфоидных фолликулов, такие как патчи Пейера. Этот антиген трансцитоза опосредовано специализированные эпителиальные клетки M 3, 4. М клетки атипичных эпителиальных клеток, которые активно фагоцитируют макромолекул и микробов. В отличие от дендритные клетки (ДК) и макрофаги, которые ориентированы на антигены в лизосомы для деградации, М клетки главным образом transcytose внутренним антигенам. Это энергичные трансцитоза макромолекулярных через ячейки M обеспечивает антиген к основной организованной лимфоидных фолликуловг, как полагают, необходимо для начала антиген-специфического иммунного ответа слизистой оболочки. Однако молекулярные механизмы, использующие этот антиген поглощение клетками М известно мало. Ранее мы уже сообщали, что гликопротеин 2 (GP2), особенно выраженные на апикальной мембране плазмы М клетки среди энтероцитов, служит рецептором для transcytotic подмножество синантропных и патогенных энтеробактерий, в том числе кишечной палочки и сальмонеллы enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium ), признав FimH, компонента типа я пили на бактериальные наружной мембраны 5. Здесь мы представляем метод применения патча мыши Пейера кишечного анализа цикла для оценки бактериальной поглощение клетками M. Этот метод является улучшенной версией мыши кишечная петля анализа описанных выше 6, 7. Улучшение точек таковы: 1. Изофлюрана был использован в качестве анестетика. 2. Примерно в 1 см лигируют кишечного включая циклПатч ING Пейера была создана. 3. Бактерии рассмотрен клетки М были помечены флуоресцентно флуоресценции реагента маркировки или гиперэкспрессией флуоресцентного белка, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP). 4. М клеток фолликула связанных эпителия покрытие патч Пейера были обнаружены целые монтажа immunostainig с анти антитела GP2. 5. Флуоресцентные бактериальных трансцитоза клетками М наблюдались с помощью конфокальной микроскопического анализа. Патч мыши Пейера кишечного анализа цикла может дать ответ какую комменсальной или патогенных бактерий трансцитоз клетками М, и может привести нам понять молекулярный механизм, как стимулировать иммунную систему слизистой оболочки через ячейки M.

Protocol

1. Подготовка бактериальных клеток Подряд глицерина заполненный люминесцентные бактерии (например, GFP выражения S. Typhimurium) на LB агар пластины, содержащей 100 мкг / мл ампициллина. Культура одну колонию из LB агар на ночь в 2 мл новая среда LB. Добавить 0,5 мл бактериальной к?…

Discussion

Инкубационный период патча лигируют Пейера с бактериальной суспензии, как правило, в течение 1 часа наблюдать бактериальный включения в клетках M. В случае 4 часа инкубации, бактерии часто обнаруживаются в зоне Т-клеток патчей Пейера. Как испаряются изофлуран анестезии ингаляционны?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить всех членов ЕИБ для развития этой техники. Работа выполнена при частичной поддержке гранта-в-помощь для научных исследований в приоритетных областях "Мембрана Трафик" (HO), и "Матрица инфекционных явлений" (KH), молодых ученых (С. Ф. и KH), а также научных исследований (HO ), а также научных исследований в инновационных областях "Внутриклеточное логистика" (HO), от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667  
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001  
Alexa Fluor 350
carboxylic acid,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168  
Inhalation anesthesia
apparatus
Shinano Seisakusho SN-487  
Fixation and
Permeabilization
Solution
BD 554722  
Anti mouse
Glycoprotein 2
antibody
MBL D278-3 200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F(ab’)2 fragment
specific
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-fold dilution
Confocal laser
scanning microscope
Leica Microsystems DMIRE2  
DeltaVision
Restoration
deconvolution
microscope
Applied Precision DeltaVision Core  

Referencias

  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
  3. Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
  4. Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
  5. Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
  6. Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
  7. Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer’s patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
  8. Owen, R. L. M cells–entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
  9. Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer’s patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
  10. Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
  11. Nagai, S. Role of Peyer’s patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).

Play Video

Citar este artículo
Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225, doi:10.3791/3225 (2011).

View Video