Le but de cet article est de démontrer une méthode pour optimiser la détection par immunofluorescence des récepteurs d'estrogènes α (ERa) chez le rat piales tranches artérielle en utilisant un microscope numérique immunofluorescence.
Beaucoup d'effets de l'oestrogène sur la réactivité vasculaire sont médiés par l'interaction avec une récepteurs d'oestrogène, 2, 3. Bien que deux sous-types existent (récepteurs des œstrogènes α-β et l'), récepteurs d'estrogènes α a été identifié dans les muscles lisses et des cellules endothéliales de la pie-mère segments artériels utilisant une coloration fluorescente combinée avec la microscopie confocale à balayage laser 4. Par ailleurs, ER-α est située dans les noyaux et dans le cytoplasme des artères basilaires de rat 5. Les récepteurs sont abondantes et fluorescentes vives, mais la visualisation claire des groupes discrets de récepteurs est difficile sans doute à cause du nombre de couches de cellules situées dans de nombreux segments de vaisseaux piales. De plus, de nombreux rapports en utilisant des techniques d'immunohistochimie couplé à la microscopie confocale mal en détail les exigences essentielles pour la reproduction des expériences 6. Notre objectif pour cet article est de décrire une technique simple pour optimiser tIl coloration et la visualisation des ER-α en utilisant transversale des tranches de artérioles piales obtenir de cerveaux de rats femelles. Nous avons d'abord perfuser rats avec bleu Evans pour identifier facilement les artères piales de surface dont nous isolons dans un microscope à dissection. L'utilisation d'un cryostat à la tranche de 8 um sections des artères nous permet d'obtenir des coupes fines cuve pour que les avions des navires différents sont plus clairement visibles. Coupe à travers le navire plutôt que l'utilisation d'un segment de vaisseau petite a l'avantage de faciliter la visualisation des couches endothéliales et musculaires lisses. En outre, l'utilisation d'un microscope numérique immunofluorescence avec le logiciel de profondeur prolongée produit des images claires de dix à douze avions navire différente et est moins coûteuse que l'utilisation d'un microscope confocal à balayage laser.
Auparavant, nous avons montré que, après une lésion cérébrale transitoire globale ischémique de la capacité des artères piales de changer de diamètre en réponse aux deux vasodilatateurs 7, 8 et 9 vasoconstricteurs est nettement déprimée chez les jeunes rats ayant subi une ovariectomie. Réplétion oestrogène chronique restaure réponses vasomotrices 7-9. En outre, le remplacement d'oestrogène retardé renverse les effets bénéfiques des œstrogènes sur l'artère la capacité de vasodilatation piales 10 nous conduit à se demander si l'épuisement oestrogènes à long terme affecte ER-α densité dans le cerebrovasculature. Nous avions prévu d'utiliser l'étiquetage immunofluorescence combiné avec Western blot pour évaluer les changements dans les ER-α expression en réponse à l'épuisement des oestrogènes chronique. Parce que nous avons eu quelques difficultés dans la visualisation des groupes discrets de récepteurs, nous avons modifié la méthode que nous démontrons ici. Par conséquent, notre objectif principal dans cette étude était de développer d'abord une méthode relativement simple pour optimiser le visuelsation des récepteurs dans les artérioles piales. En accord avec plusieurs rapports 6,11,12 nous avons jugé nécessaire de faire des ajustements pour le type de tissu nous sonder, l'épaisseur de l'échantillon, la répartition des ER-α dans la cuve, ainsi que le degré de liaison non-spécifique .
Notre méthode est très efficace de visualiser la présence de ER-α en tranches navire piales. Mais comme d'autres l'ont déjà souligné la bonne utilisation de ces méthodes est très dépendante de la spécificité et des concentrations de l'anticorps, la localisation subcellulaire des protéines d'intérêt, la fixation et le blocage des protocoles et 12 manipulation des tissus. Avant de visualisation de nos préparatifs, nous avons passé des navires de temps pour travailler sur toutes ces variables. Nous avons souligné combien nous avions besoin d'ajuster certains de notre approche dans ce document.
Nous avons cherché à visualiser de manière optimale ER-α dans les artérioles piales et cela a présenté un certain nombre de défis.Tout d'abord, la taille moyenne d'une artère de rat piales est entre 35-50 um faisant l'isolement et le retrait de la surface du cerveau assez délicat. Nous avons constaté que la perfusion avec bleu Evans avant le sacrifice fait la dissection des artères plus facile. Bleu Evans peut affecter la fluorescence, mais nous pensons que l'avantage d'utiliser ce colorant l'emportent sur ses inconvénients mineurs. Dans notre protocole, les navires sont lavées plusieurs fois. Cela minimise le colorant résiduel dans les vaisseaux et réduit les effets possibles de la teinture sur la fluorescence. Une autre difficulté rencontrée est que l'épaisseur de la pie-mère fait les segments de flotte visualisation claire des récepteurs difficile. De plus, nous n'avons pas pu obtenir des images particulièrement claires probablement dû au fait que les ER-α a été dispersée à travers plusieurs couches de cellules. Nous avons essayé de travailler avec des tranches de navires longitudinales (comme d'autres l'ont), mais en raison de la petite taille piales il était difficile de gérer les navires et éviter la torsion des vaisseaux pendant le montagesur des lames, même à l'aide d'un microscope. Enfin, nous avons réussi modifié notre technique en utilisant un cryostat et la découpe du navire de la Croix-sage dans les anneaux à 8 um d'épaisseur. Les anneaux sont plus faciles à manipuler et à plusieurs peut être monté sur une glissière.
Une fois que nous avons acquis les bateaux nous avons jugé nécessaire de tester l'efficacité du premier flash geler le tissu, puis fixer les vaisseaux comme suggéré par Danseshatalb et associés 11. Bien que nous avons trouvé immunofluorescence de fond un peu moins, nous avons également noté que les récepteurs tachés moins intensément rendant la visualisation des récepteurs plus difficile. Par conséquent, nous préférons d'abord de geler l'ensemble du cerveau et de stocker jusqu'à ce que nécessaire (généralement entre 1-2 mois). Nous avons ensuite retirer les vaisseaux tels que décrits et fixer les bateaux avant le tranchage avec le cryostat. comme nous le démontrons ici.
Une étape nécessaire consiste à exécuter des contrôles à la fois avec le primaire et l'anticorps secondaire séparémentpour déterminer la spécificité et l'immunofluorescence fond. Récepteurs aux œstrogènes α-anticorps peut être difficile de travailler avec. En fait, nous avons essayé trois différents anticorps primaires (1 et 2 monoclonal polyclonaux) avant que nous soyons satisfaits de la réussite de notre coloration récepteur. Dans le cadre de nos contrôles nous avons d'abord vérifié la spécificité de l'anticorps primaire par omission de l'ajout de l'anticorps primaire. Figure 2D montre le navire sans anticorps primaire. Il n'ya pas de coloration et juste un signal de fond peu. Depuis l'anticorps primaire est polyclonale, il ya une certaine coloration fond diffus non spécifique. Deuxièmement, nous avons ajouté l'anticorps primaire, mais pas l'anticorps secondaire (Fig. 2E). On peut voir une belle marge représentant la autofluoresence le long des frontières endothéliales des vaisseaux. Ceci est cohérent avec le travail de Dan et associés 5. Toutefois, ni les petits points de l'immunofluorescence qui représentent ER-α, ni la ref aspect granuleuxlecting la présence de nombreux récepteurs peuvent être détectées sans la combinaison de deux anticorps primaires et secondaires. Nous avons noté une tendance distincte des autofluoresence le long des marges endothéliales des vaisseaux. Ces tests indépendants pour la spécificité des anticorps sont importants car ils confirment la spécificité de l'anticorps pour ER-α et l'anticorps secondaire se lie à la primaire.
En conclusion, comme l'a démontré par d'autres 4, 5 vaisseaux sanguins du cerveau contiennent de nombreux ER-α sous-type de récepteurs. Dans nos mains, la préparation de la Croix-8μm tranches transversales du isolées artères piales améliore la coloration et la visualisation des récepteurs. Les méthodes traditionnelles utilisent la microscopie confocale pour examiner les échantillons. Ayant la capacité de visualiser des sections optiques de série à partir de spécimens d'épaisseur est un avantage important de la microscopie confocale. Toutefois, l'achat d'un microscope confocal à bonne peut être très coûteux. En utilisant Extended Depth (FED) de logiciels, nous avons constaté quepourraient réduire nos coûts d'équipement. En utilisant un microscope à fluorescence avec EDF, nous avons obtenu des images claires et sont capables de visualiser piales artérielle ER-α sur plusieurs niveaux en utilisant Z-piles. Un avantage significatif du logiciel d'EDF est qu'il permet la capture d'image de manière à créer efficacement une image 3-D à partir des images. Pour les laboratoires qui n'ont pas accès à un microscope confocal ou les fonds pour acheter un microscope numérique fluorescent avec le logiciel approprié peut être une option pratique et moins coûteux en fonction des objectifs de l'enquêteur.
The authors have nothing to disclose.
Les travaux pour ce projet a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health R01-NR5339 et de la Uniformed Services University de la Santé de Sciences-R061LD.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
EVANS BLUE | Sigma | E-2129 |
PBS 10X | Sigma | P-5493 |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 |
Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR | 25608-930 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 |
Triton X-100 | Sigma | T9284 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 |
ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz | H-184 |
Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 |
Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI |
Vector Lab | H-1200 |