Vi beskriver ett<em> In vitro</em> Metod för odling schistosomula av plattmask parasiten<em> Schistosoma mansoni</em>, Via skörd och omvandling av infektiösa cercariae från färska mellanliggande vatten snigel värd Biomphalaria glabrata.
Schistosome parasiter är de smittämnen bilharzia, en kroniskt funktionsnedsättande sjukdom som drabbar över 200 miljoner människor i världen och tvåa i malaria bland parasitsjukdomar i termer av hälsa och socio-ekonomiska effekter (1-4). Schistosome parasiter är trematode maskar med en komplex livscykel utbyta mellan ett parasitiskt liv i blötdjur och däggdjur värdar med mellanliggande frisimmande steg. Kortfattat, frisimmande cercariae infektera ett däggdjur värd genom att tränga in i huden med hjälp av utsöndras proteaser, under vilken tid cercariae förlorar sina svansar, förvandlas till schistosomules. Den schistosomules måste nu undvika värdens immunsystem, utveckla en intuitiv för rötning av röda blodkroppar, och migrera även om lungorna och portalen cirkulation på väg till slutdestinationen i levern portalen systemet och så småningom mesenteriala vener (för S. mansoni) där manliga och kvinnliga maskar par och parar sig, producera hundratals ägg per dag. Några av äggen utsöndras från kroppen i sötvatten, där äggen kläcks till frisimmande miracidia (5-10). Den miracidia infektera specifika snigelarter och förvandlas till mor och dotter sporocysts, vilket i sin tur producerar smittsam cercariae, slutföra livscykel. Tyvärr kan hela schistosome livscykeln inte odlas in vitro, men infektiösa cercariae kan förvandlas till schistosomules och schistosomules kan odlas i veckor för analys av schistosome utveckling in vitro eller microarray analys. I detta protokoll ger vi en visuell beskrivning av cercarial omvandling och in vitro-odling av schistosomules. Vi skjul smittsamma cercariae från snigel värd Biomphalaria glabrata och manuellt omvandla dem till schistosomules genom att lossa sin svans med en emulgerande dubbelkanyl. In vitro cercarial omvandling och schistosomules tekniker kultur beskrivs undvika användning av ett däggdjur värd, vilket underlättar visualisering av schistosomes och underlättar insamling av parasiten för experimentell analys. In vitro transformation och tekniker odling av schistosomes har gjorts i flera år (11, 12), men inga visuella protokoll har utvecklats som är tillgängliga för hela samhället.
Flera potentiella problem kan uppstå under omvandlingen förfarande, dock är detta protokoll syftar till att undvika de flesta av dessa problem. En potentiell fara är igensättning av emulgering nål, som oftast uppstår på grund av skräp kvar från skörden i steg 1,3. Var noga med att alla partiklar att bosätta sig i steg 1,5 och överföra cercariae försiktigt i steg 1,6 för att undvika detta problem. Även, som beskrivits tidigare, arbeta inuti en biologisk säkerhetsbänk, användning av personlig skyddsutrustning (även ansiktsskydd) och undvikande av alltför stora tryck på sprutor rekommenderas.
Fristående cercarial svansar kan visualiseras i media, vilket tyder på dålig separation under steg 2,9. Den svansar uppvisar en spasm-liknande rörelse och har en tydlig form (se figur 2), och thusly är lätt att skilja från schistosomules. Den svansar kan tas bort genom att tvätta schistosomules över RPMI kompletta låta schistosomules att lösa. Den svansar förblir flytande och kan dammsugas upp.
Om intakt cercariae finns i media, var förvandlingen i steg 2,5 inte utförs på rätt sätt. En bild av en intakt cercaria visas i Figur 3b som referens. Om detta problem uppstår, försäkra att de emulgerande nålen som används är av rätt storlek. Dessutom kan många gånger cercarial blandningen leds genom nålen ökas, men 40 gånger är vanligtvis mycket mer än tillräckligt för att närma sig 100% klippning av cercarial svansar.
Omvandling av cercaria i schistosomules beskrevs första gången 1974 av Colley och Wikel (13). Sedan dess har förberedelserna schistosomules skett antingen med klippning strategi med en nål och spruta som beskrivs i detta protokoll, eller använda en vortexa strategi och separeras med gradienter av Percoll (14, 15) eller virvlande vilket framgår i detta dokument. Dessa två tekniker för att förbereda schistosomules är vackert beskrivs av Fred Lewis (16) och mer information för vidare odling av schistosomules för långsiktig tillväxt kan hittas på NIAID Schistosome Resource Center ( www.schisto-resource.org ).
The authors have nothing to disclose.
Projektet har finansierats av Case Western Reserve University start medel till E. Jolly. Infekterade sniglar lämnades av Schistosome Resource Center, NIH-NIAID (NIAID Kontrakt nr HHSN272201000009I). Vi vill också tacka Chris King och Ronald Blanton som stöd för att säkra infekterade schistosome sniglar och hjälpsamma diskussioner.
Name of reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
22g x 2-7/8″ Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G |
RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 |
Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 |
Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 |
Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D |
General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C |
Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |