Cercarial परिवर्तन और इन विट्रो में की खेती शिस्टोस्टोमा mansoni Schistosomules
Summary
हम एक का वर्णन<em> इन विट्रो में</em> Flatworm परजीवी के संवर्धन schistosomula के लिए विधि<em> शिस्टोस्टोमा mansoni</em> संचयन और ताजा पानी घोंघा मध्यवर्ती मेजबान Biomphalaria glabrata से संक्रामक cercariae के परिवर्तन के माध्यम से.
Abstract
Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.
Protocol
Discussion
कई संभावित समस्याओं परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न हो सकता है, तथापि, इस प्रोटोकॉल के लिए इन समस्याओं के अधिकांश से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है. एक संभावित खतरा पायसीकारी सुई है, जो आम तौर पर 1.3 चरण में कटाई से बचे मलबे के कारण पैदा होती है के clogging है. सभी कण 1.5 चरण में बसने और 1.6 चरण में cercariae ध्यान से हस्तांतरण की बात इस समस्या से बचने के लिए अनुमति के लिए यकीन है. इसके अलावा, के रूप में पहले वर्णित है, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर काम, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग (भी चेहरा ढाल) और सीरिंज पर अत्यधिक दबाव के बचाव की सलाह दी जाती है.
अलग cercarial पूंछ मीडिया है, जो 2.9 चरण के दौरान गरीब जुदाई का संकेत है में visualized किया जा सकता. पूंछ प्रदर्शन ऐंठन की तरह एक प्रस्ताव और एक अलग आकार है (देखें चित्र 2), और thusly schistosomules से आसानी से अलग पहचाना जाता है. पूंछ RPMI के अतिरिक्त में schistosomules धोने पूरा schistosomules को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति द्वारा हटाया जा सकता है. पूंछ अस्थायी रहना और बंद vacuumed जा सकता है.
यदि बरकरार cercariae मीडिया में मौजूद हैं, 2.5 चरण में परिवर्तन ठीक से नहीं मार डाला गया था. चित्रा 3b में संदर्भ के लिए एक अक्षुण्ण cercaria की एक छवि में दिखाया गया है. यदि इस समस्या तब होती है, तो बीमा, कि पायसीकारी सुई इस्तेमाल किया जा रहा उचित आकार का है. इसके अलावा, cercarial मिश्रण सुई के माध्यम से पारित कर दिया है बार की संख्या बढ़ा जा सकता है, हालांकि 40 गुना आम तौर पर cercarial पूंछ के 100% कर्तन दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त से अधिक है.
Cercaria के schistosomules में परिवर्तन पहली बार Colley और Wikel (13) द्वारा 1974 में वर्णित किया गया था. तब से, schistosomules की तैयारी एक सुई और सिरिंज के साथ या तो बाल काटना रणनीति का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है, या एक vortexing दृष्टिकोण का उपयोग कर और percoll के gradients के साथ अलग (14, 15) या घूमता रूप में इस पत्र में प्रदर्शन किया गया है. Schistosomules की तैयारी के लिए ये दो तकनीकों खूबसूरती फ्रेड (16) लुईस और दीर्घकालिक विकास के लिए schistosomules के आगे संवर्धन के लिए अधिक जानकारी NIAID Schistosome संसाधन केंद्र (में पाया जा सकता द्वारा वर्णित हैं www.schisto resource.org ).
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय स्टार्टअप ई. जॉली के लिए उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. संक्रमित घोंघे Schistosome रिसोर्स सेंटर, एनआईएच NIAID (NIAID अनुबंध सं. HHSN272201000009I) द्वारा उपलब्ध कराए गए. हम भी क्रिस राजा और रोनाल्ड Blanton संक्रमित schistosome घोंघे हासिल करने में समर्थन के लिए और उपयोगी विचार – विमर्श के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 22g x 2-7/8″ Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
Referencias
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