Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани
Summary
Простой и надежный метод изоляции и культуры нервных стволовых клеток из выброшенных человеческого плода корковой ткани описано. Культуры, полученные из известных человеческих неврологические расстройства могут быть использованы для характеристики патологических клеточных и молекулярных процессов, а также обеспечит платформу для оценки фармакологической эффективности.
Abstract
Нервные стволовые клетки (NSCs) проживают вместе нейроэпителия зоны желудочков во время развития кортикальной пластинки. Эти ранние предшественники в конечном счете привести к промежуточной прародителей и позже, различных нервных и глиальных клеток подтипов, которые образуют кору головного мозга. Способность генерировать и расширить человеческие NSCs (так называемые нейросферы) из выброшенных нормальной эмбриональной ткани обеспечивает средства, с которыми непосредственно изучать функциональные аспекты нормального человеческого развития НСК 1-5. Этот подход может также быть направлена на генерацию NSCs от известных неврологических расстройств, тем самым предоставив возможность определить болезненные процессы, которые изменяют предшественников пролиферации, миграции и дифференциации 6-9. Мы сосредоточились на выявлении патологических механизмов в человеческом Вниз NSCs синдром, который может способствовать болезни фенотип ускоренного Альцгеймера 10,11. Ни в естественных условиях, ни в лабораторных мышах может повторить идентичных репертуар генов, расположенных на хромосомы человека 21.
Здесь мы используем простой и надежный способ, чтобы изолировать синдромом Дауна NSCs из абортированных человеческих эмбриональных коры и вырастить их в культуру. Методология предусматривает конкретные аспекты уборки ткани, рассечение с ограниченными ориентиры анатомические, сортировки клеток, покрытий и пассажи человека NSCs. Мы также предоставляем некоторые основные протоколы для индукции дифференциации человеческого NSCs в более избирательным подтипа клетки.
Protocol
Discussion
Существуют различные подходы к культуре свежей ткани и производство человеческих клеточных линий. Исторически сложилось так, свежей ткани были собраны и культурным сразу генерировать различные типы клеток в центральной нервной системе. Этот подход, однако, четко ограничено количест?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья: HD054347 и NS063997-01 к VLS. Эта работа также была частично поддержана Стволовые Эмпайр-Стейт-Сотовый фонд через Нью-Йорк Департамент здравоохранения штата Договор № C024324 для VLS. Мнения, высказанные здесь, являются исключительно автору и не обязательно отражают точку зрения Стволовые Эмпайр-Стейт-Сотовый совета штата Нью-Йорк Департамент здравоохранения, и штата Нью-Йорк. VLS является Дорис Дьюк Клинические Ученый развитием получателя премии. Мы также благодарим профессора Тимоти Вартанян за его дар Anti-O1, Анти-O4 антител.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
Referencias
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O’Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down’s syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r., Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?. Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
