Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.
Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ist eng mit zeitlichen und räumlichen Regulation von mehreren wichtigen Signalwege gesteuert. Eine der Hürden, die ihr Verständnis hat die verschiedensten Methoden in Korrelation Veränderungen der wichtigsten Signalwege zur Differenzierung Effizienz. Wir beschreiben hier die Verwendung einer Maus embryonale Stammzellen (ES) zellbasierten Assay auf kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Mit Scoring für Contracting embryonalen Körper (EVG) in einer 96-Well-Platte formatieren, können wir schnell zu quantifizieren kardiogenen Effizienz und identifizieren wichtige Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal-Aktivierung in einen zeitlichen Verlauf folgenden spezifischen Modulator Behandlungen. Die wichtigsten hier skizzierte ist nicht die kardiale Induktion allein, begrenzt und kann nach dem Studium vieler anderer Zelllinien eingesetzt werden. Darüber hinaus hat der 96-Well-Format das Potenzial, weiter als einen hohen Durchsatz, automatisierte Tests für die Prüfung von mehr anspruchsvolle experimentelle Hypothesen ermöglichen entwickelt werden.
Die hängenden Tropfen Methode hat den herkömmlichen Verfahren zur EB Bildung und In-vitro-Differenzierung verwendet worden. Es ist jedoch mühsam und Grenzen experimentellen Flexibilität durch logistische Belange. Aus dem gleichen Grund werden die Ergebnisse auch schwieriger zu validieren als die Geschicklichkeit des Experimentators ist entscheidend für die erfolgreiche EB Bildung und Manipulation als hängende Tropfen. Eine einfachere Methode ist die EBs in einen Rundkolben 96-Well-Platte als ein einstufiges Verfahren zu bilden. Dieses Format ermöglicht in vitro-Differenzierung zu standardisieren und kann mehr experimentellen Bedingungen durch die Leichtigkeit des EB Bildung und nachgelagerten Manipulation (zB Modulator Hinzufügen oder Entfernen) unterzubringen. Darüber hinaus kann die 96-Well-Platten-Format optimiert, um eine effiziente Screening-Instrument in Maus-ES-Zellen werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Veterans Affairs und NIH gewährt 5U01HL100398 und 1R01HL104040 unterstützt.