Связанные хромосомы Ловушка для выявления дальних взаимодействий ДНК

1. Формальдегид фиксации дальних взаимодействий хроматина Культура человека клеточной линии HL-60 в RPMI1640 среде с 15% FBS и 1 х пенициллина / стрептомицина до 80-90% слияния в инкубатор поставляется с 5% CO 2 при температуре 37 ° C. Сбор клеток в 50-мл Nunc трубки, центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 15 минут, а затем удалить среде стремление Добавьте 5 мл культуральной среды для ресуспендирования ячейки гранул, и подсчитать клетки, используя гемоцитометра. Возьмите примерно 1 х 10 7 клеток в объеме 40 мл с RPMI1640 / 10% FBS, затем добавьте 1,7 мл 37% формальдегида исправить разбавленный хроматина. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут с осторожном встряхивании, а затем погасить с 2,4 мл 2 М глицина. Центрифуга течение 15 минут при 1200 оборотов в минуту при температуре 4 ° С, и удалите супернатант. Вымойте гранул раз с 40 мл ледяной PBS, то спином вниз гранул и удалить PBS. 2. Лизиса клеток, чтобы изолировать ядер Ресуспендируют клеток в 40 мл ледяной буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl, pH8.0, 10 мМ NaCl, 0,2% NP-40) с только что добавил ингибиторы протеазы (1:500 разведение) и 0,1 мМ PMSF. Инкубируйте в холодной комнате с вращением в течение 90 минут, центрифуге при 2500 оборотов в минуту в течение 15 минут, и удалить супернатант. 3. Ограничение ферментативного расщепления с Bgl II Ресуспендируют ядер в 0,5 мл 1 х NEB буфера 3, и добавить 15 μlof 10% SDS. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа при встряхивании, затем добавить 45 мкл 20% Triton X-100 на секвестр SDS. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа при встряхивании. Используйте аликвоту 1 х 10 6 ядер (около 15 мкг, одна десятая часть оригинальной клетки) для ограничения пищеварения фермента. Выньте 55 мкл ядер решение с шага 3.1 и составляют до 500 мкл 433 мкл 1 х NEB буфера 3 и 12 мкл Bgl II (50U/ul). Инкубировать при 37 ° С в течение ночи. 4. Лигирование взаимодействующих сегментов ДНК Деактивировать рестрикции путем добавления 95 мкл 10% SDS, и денатурации нагреванием при 65 ° С в течение 20 минут на водяной бане. Добавить 7 мл 1 х перевязки буфера (30 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl 2, 10 мМ DTT, 1 мМ АТФ) и 360 мкл 20% Triton X-100 и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа . Нижняя температура до 16 ° С и добавить 50 мкл 400 ед / мкл T4 ДНК-лигазы. Инкубируйте образца при 16 ° С в течение 4 часов, а затем при комнатной температуре в течение 30 минут. 5. Очистка ДНК Добавить 300 мкг протеиназы К, и инкубировать при температуре 65 ° С в течение ночи. Добавить 5 мкг РНКазы и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 30 минут Purify ДНК фенол / хлороформ добычи, и осадок ДНК в изопропаноле. Растворите ДНК в 150 мкл стерильной дистиллированной водой. 6. Пищеварение с Msp я и перевязки с олигонуклеотидных линкеров Инкубируйте 2μg очищенной ДНК с 5 единиц Msp я при 37 ° С в течение 4-6 часов. Деактивировать Msp я при температуре 65 ° С в течение 10 минут, затем осадок ДНК в этаноле с 1 мкл 5 мг / мл гликогена. Растворите гранулы ДНК в 50 мкл стерильной дистиллированной водой. Смешать 50 мкл Msp я обработанных ДНК с 2 мкл 20 мкМ компоновщик L олигонуклеотида (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 мкл 20 мкМ олигонуклеотида S (5'-cggtgaatc-3'), 1 мкл стерильной дистиллированной воды и 6 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера. Обложка смеси с жидким воском. Денатурировать олигонуклеотидов при 50 ° С в течение 1 минуты и дайте остыть постепенно до 10 ° С в 0,5 ° С / мин градиент в термоциклер. Добавить 1 мкл 400 ед / мкл T4 ДНК-лигазы и инкубировать при 15 ° С в течение ночи. Purify компоновщик-лигируют ДНК с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект, и вымывается в 50 мкл стерильной дистиллированной водой. 7. ПЦР-амплификации и анализа последовательностей Выбор грунта для конкретного региона ДНК, которые вы хотите просмотреть на большие расстояния взаимодействия (например, "приманка"). В этом примере мы используем ABL-1. Принимать по 1 мкл очищенной ДНК, чтобы выполнить первый раунд ПЦР, используя 1 мкл 20 мкМ ABL -1 специфического праймера # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 мкл 20 мкМ компоновщик специфического праймера # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейль и 3 мкл стерильной дистиллированной водой. Два мкл 32 Р-дЦТФ добавляют 100 мкл 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейля перед ПЦР. Термического цикла на горячий старт ПЦР 72 ° С в течение 2 мин, 95 ° КСОР 2 минуты, 18 циклов 95 ° C в течение 20 секунд, 65 ° C в течение 40 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты; последнее продление проводится при температуре 72 ° Cв течение 5 минут. Purify первом раунде продуктов ПЦР с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект, и элюции ДНК в 30 мкл стерильной дистиллированной водой. Принимать по 1 мкл 100 х разбавленной первым продуктом ПЦР для выполнения второй раунд ПЦР с вложенными праймерами, добавляя 1 мкл 20 мкМ ABL-1 специфического праймера # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (рис. 1а), 1 мкл от 20 мкМ компоновщик специфического праймера # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 мкл 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейль и 3 мкл стерильной дистиллированной водой. Тепловой график велосипеде 25 циклов 95 ° С в течение 20 секунд, 67 ° С в течение 40 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты, а затем расширение при 72 ° С в течение 5 минут. Визуализация продуктов ПЦР, запустив 5% мочевины-PAGE гель и сканирования подвергается экране в PhosphoImager (рис. 1b). Каждая полоса ПЦР могут быть переработаны из геля путем растворения геля полосы в пробирку Эппендорфа, содержащие 60 мкл стерильной дистиллированной воды, и инкубации при температуре 95 ° С в течение 5 минут. Центрифуга кратко на 10000 оборотов в минуту в течение 10 секунд, чтобы собрать все образцы. Удалить 1 мкл для использования в качестве ДНК-матрицы для выполнения ПЦР с 2961/4626 пары праймеров с использованием тех же условиях, как описано выше. Анализ последовательности могут быть выполнены после очистки с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект. Последовательности ДНК анализировали с помощью онлайн-инструмент для определения их хромосомного место на веб-сайте: http://genome.ucsc.edu (рис. 1в). Нажмите на кнопку "блат", чтобы ввести новое окно, которое позволяет вставить последовательность ДНК, новое окно, после нажатия "Отправить", и показывает, "блат Результаты поиска». Нажмите на кнопку "браузер" хит-со 100% идентичности ввести следующее окно, чтобы показать расположение последовательности ДНК. 8. Представитель Результаты 1. ACT методом с использованием ABL-1 регион в качестве приманки, чтобы определить свою долгую взаимодействий ДНК-диапазона Как показано на рисунке 1а, два Bgl II-сайты и один BamH Я сайта были выбраны для анализа ACT. Во втором раунде ПЦР, грунтовки набор 4626/2961 был использован для усиления ABL-М1, 4630/2961 был использован для ABL-М2 и 4636/2961 был использован для ABL-M3. Типичная картина показывает, гель от одного до нескольких полос (рис. 1b). Каждый фрагмент из анализа ACT состоит из двух комбинированных сегментов ДНК: один сегмент является производным от региона ДНК приманки, а во втором сегменте происходит от ассоциированного участника, который был присоединен к сегменту регионе приманку на первой последовательности ферментов признание ограничений. Вторая последовательность признание фермента появится в конце ассоциированный партнер последовательности (рис. 1в). Клонированных ABL-М1 фрагмент содержит ДНК из области ABL1 находится на хромосоме 9q32.4 от +133,592,306-133,592,399 и ассоциированный партнер находится на хромосоме 3p13 от +71,869,882-71,870,107. Личности связаны партнеры обнаружены взрывные их последовательностей с помощью УСК браузер генома (GRCh7/hg19 выпущен в феврале 2009 года). PROK2 было определено в качестве ассоциированного партнера в chr3p13 локуса. Кроме того, ABL-M2 ассоциированный партнер был локализован в chr5q21.1, а клон ABL-M3 был идентифицирован как внутри-хромосомных ассоциации возле ABL-1 локуса. 2. Определение реже долго взаимодействия диапазон, используя ACT анализа Другие анализы, основанные на 3C сообщили многие другие взаимодействующих партнеров, чем у нас показано на рисунке 1 и в Igf2 / H19 локус 12. Методология, что мы наметили выберет наиболее распространенных долго взаимодействия диапазона. Тем не менее, за счет увеличения количества циклов ПЦР можно определить дополнительные, менее частые ассоциации, а также (рис. 2). 3. Различия в длинный ряд взаимодействий в раковых клетках, по сравнению с нормальными тканями. Анализ ACT также может быть использован для выявления различий в ядерной архитектуры и долго взаимодействия в диапазоне от нормальных клеток и раковых клеток (рис. 3). Эти различия могут отражать изменения ядерной архитектуры, которые происходят во время клеточного трансформации, и таким образом этот анализ в конечном итоге может применяться в диагностических целях. Аналогичные модели геля, которые происходят как в нормальных и раковых тканей показал, что анализ ACT является надежным и повторяемым. Хотя анализ ACT может определить дальний ДНК партнеров, дальнейшего анализа, таких как рыбы и чип анализы, необходимые для проверки наличия выявленных ассоциаций между удаленными локусов. Генетические, физиологические и биохимические исследования могут быть выполнены, чтобы выяснить биологические последствия этих долгих ассоциации ДНК диапазона. Рисунок 1 ACT методом с использованием ABL-1 регион в качестве приманки ДНК в HL-60 клеток. a. ДНК-структурыЮр в ABL-1 региона. Первый фермент ограничения, используемые в ACT анализа была Bgl II. Праймеров для второго раунда ПЦР также помечены стрелками и соответствующими номерами грунт. b. Гель структуры АСТ тест, в 5% мочевины-PAGE. Грунтовка пары 4626/2961 был использован для усиления клон ABL-М1 в ПЦР, 4630/2961 был использован для клона ABL-М2 и 4636/2961 был использован для клона ABL-M3. c. Последовательность ДНК клона ABL-M1. Фрагмент ДНК из ABL-1 приманку ДНК обозначена красным цветом, а ассоциированный партнер ДНК обозначена в голубой цвет. Bgl II сайт (AGACTC) был назван в зеленый и Msp Я сайта (КСДУ) обозначено фиолетовым цветом. Рисунок 2 циклов ПЦР повлиять на результаты ACT анализа. Использование регионе импринтинга управления (ICR) в Igf2/H19 локус в качестве приманки ДНК в клетках мыши фибробластов, различных программ велосипедного были применены в первом и втором раундах ПЦР в ACT анализа. 18-20 циклов в первом раунде ПЦР не усиливают сигнал достаточно для визуализации. Двадцать пять циклов во втором результатов ПЦР в ясную полосы, а при увеличении числа циклов для второго раунда ПЦР-индуцированной мазок картины в дополнение к более полос. Рисунок 3 Обнаружение различий в ядерной архитектуры между нормальной ткани толстой кишки и тканей рака толстой кишки в анализе ACT. A. ДНК-структуры региона ICR на IGF2/H19 локус и IGF2 гена. ДПН II сайтов для анализа ACT помечены. Грунтовки использоваться во втором раунде ПЦР помечены стрелками и цифрами в разные цвета, которые соответствуют каждой полосы в панели б фигуры. b. Гель структуры АСТ тест, в 5% мочевины-PAGE. Нормальные ткани толстой кишки MAD03-1423 и рак толстой кишки ткани MAD04-149 была получена от совместной Сети по вопросам людских тканей (CHTN) Западная дивизии. После каждой толстой ткани гомогенизировали, ACT анализ был выполнен в соответствии с процедурами, описанных здесь. Полоса 1 представляет ПЦР результаты, используя пары праймеров # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 '), помеченные в розовом в панели; переулок 2 представляет ПЦР результаты, используя пары праймеров # 2961 и # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') помечены оранжевым цветом в панели; переулок 3 представляет результаты с помощью ПЦР пары праймеров # 2961 и # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') помечены синим цветом в панели; переулок 4 представляет результаты с помощью ПЦР пары праймеров # 2961 и № 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') помечены зеленым цветом в панели a. Уникальные группы, которые появляются только в нормальной ткани толстой кишки помечены желтыми стрелками, а те группы, которые появились только в толстой ткани рака помечены красными стрелками. МЦР, импринтинга управления региона; ПМР, различных метилированных регионе.