نحن هنا تصف عكس متعددة الأمثل المنتسخة PCR الكمي (qRT – PCR) بروتوكول بالاشتراك مع منصة ميكروفلويديك من حيث التكلفة والوقت أداة فعالة الفرز الفائق الإنتاجية للmicroRNA (ميرنا) مستويات التعبير ، وخاصة عند العمل مع كميات محدودة من العينة.
وقد أدى تدخل واسع من العمليات الحرجة في miRNAs الكامنة التنمية ، والأنسجة homoeostasis المرض إلى اهتمام المتزايد بين المجتمعات والبحوث الدوائية. لدراسة miRNAs ، فمن الضروري أن القياس الكمي لمستويات microRNA دقيقة وقوية. بمقارنة البرية من نوع خلايا الحمض النووي الريبي للمشاريع الصغيرة الجذعية الجنينية ناقصة (مسك) ، وكشف لنا عدم وجود دقة ومتانة في السابق نشر تقنيات متعددة qRT – PCR. هنا ، نحن تصف أسلوب الأمثل ، بما في ذلك تنقية بعيدا الاشعال المفرط من الخطوات السابقة قبل الكشف المتعدد singleplex الوقت الحقيقي ، مما يزيد بشكل كبير من دقة ومتانة الأسلوب. علاوة على ذلك ، يمكننا أن نفسر كيف يؤدون هذه التقنية على رقاقة ميكروفلويديك في أحجام نانولتر يقلل كثيرا من تكاليف كاشف وسمح الوقت فعالة ميرنا إنتاجية عالية التنميط التعبير.
miRNAs قصيرة (18-24 النيوكليوتيدات) ، غير الترميز RNAs وميرنا ، التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally من قبل كل من الرنا الرسول زعزعة الاستقرار (مرنا) ، وتحول دون ترجمتها. 6 وحقيقة أن ما لا يقل عن ثلث الجينات البشرية تحتوي على الحفظ ملزمة مواقع في 3'UTR والتفاعل واضحا من miRNAs مع الجينات للانتشار ، وموت الخلايا المبرمج تعدد القدرات تقترح مساهمة حاسمة في اتخاذ القرارات مصير الخلية ، الأنسجة والتوازن أمراض مثل السرطان. microRNA التعبير 6،7 دقيقة لذلك هي الملامح العريضة الفائدة.
لاختبار متعددة نشرت qRT – PCR التنميط التعبير بروتوكول ميرنا 2 استخدمنا الصغيرة RNA MESC أنها مقصرة ضوابط السلبية. DGCR8 — / — تعاني من نقص خلايا جميع microRNAs الكنسي ، في حين أن المقامر — / — نقص خلايا micoRNAs الكنسي على حد سواء وعدم canoncial – 8،9
مقارنة مستويات في نوع البرية MES إلى DGCR8 — / — الخلايا ، وكشف لنا عدم وجود دقة وأعرب عن عدة لم يتم اكتشاف 10 microRNAs في الخلايا البرية من نوع 11. وأظهرت بعض حتى انخفاض مستويات التعبير النسبي للخلايا خروج المغلوب (الشكل 3A). افترضنا أنه قد يكون السبب في عدم مراعاة الدقة من قبل التمهيدي ضخمة تحمل أكثر من خطوتين متتاليتين متعددة (RT PCR وتمهيدي) قبل الكمي – RT singleplex. ومع ذلك ، متعددة قبل التضخيم ضروري لتحسين قوة الإشارة ، وخصوصا عندما يقتصر تركيز بدءا من الحمض النووي الريبي. بعيدا عن طريق تنقية قبل PCR المنتجات من الاشعال عن طريق الانتقاء في حجم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلي (الشكل 2) ، فإننا يمكن أن يبرهن على وجود تحسن كبير في الدقة عن طريق الكشف عن مزيد من microRNAs وفقدان اشارات ايجابية كاذبة في كل Dgcr8 — / — والمقامر — / — خلفيات (أرقام 3a و 3B) بالإضافة إلى تعديل qRT – PCR النهج سمح لتصنيف المناسبة النادرة Dgcr8 الرناوات المستقل / المقامر صغيرة تعتمد على (الشكل 3B) 11. بالتالي خطوة إضافية لتنقية الاشعال المفرط بعيدا عن المنتج قبل PCR هو مفيد بشكل واضح ، خاصة عند استخدام مجموعات كبيرة التمهيدي متعددة لكل عينة.
يتم تحديد العدد الأمثل للدورات السابقة للتضخيم وفقا لتركيزات الحمض النووي الريبي الإدخال. وينبغي أن يسترشد على التوازن الذي لا يخضع لأو overamplify بواسطة تفاصيل تجربة محددة.
مع أكثر من ألف microRNAs المعروفة ، واستخدام معيار 384 لوحات جيدا قد لا تكون الأمثل لالتنميط microRNA واسعة النطاق ، وخصوصا عندما تقارن عينات متعددة. Fluidigm مؤسسة التمويل الدولية في صفيف حيوية تمكن ، مع انخفاض كبير في عدد الخطوات اللازمة pipetting والكيمياء ، واختبار ما يصل الى 96 عينات الفرد من 96 microRNAs مختلفة في تجربة واحدة (9216 ردود فعل) على نطاق واسع نانولتر (6.7 NL). لكل تشغيل البرنامج يوفر تحليل المنحنيات التضخيم ، وخرائط الحرارة مرمزة والقيم عتبة دورة (CT). في وقت واحد على نطاق واسع التنميط يقلل الفروق التجريبية ، ويتيح التعبير يعني التطبيع قيمة ، والذي ينفذ خارج استراتيجيات التطبيع الأخرى التي تجعل من استخدام الضوابط RNA الصغيرة (12).
بالمقارنة مع 384 منصات متوفرة تجاريا جيدا مع تحقيقات TaqMan قبل تعيينه ، فإن الجمع بين منصة عالية الإنتاجية التنميط مع مجموعات التمهيدي مصنوعة خصيصا يوفر مرونة عالية التجريبية.
والأمثل متعددة qRT – PCR النهج في تركيبة مع منصة صفيف الحيوي يسمح بنجاح الشاشة في وقت واحد منا أن 48 مريض السرطان الأمصال البروستاتا لإحداث تغييرات في مستويات من 384 ميرنا (الشكل 4) وتطبيع البيانات دون زيادة كبيرة في التحكم (أي الاصطناعية microRNAs). 11
على الرغم من الزيادة من الخطوات من العينات تمهيدا لنتائج التنميط ، والنهج صفها هو الوقت والتكلفة الفعالة أسلوب إنتاجية عالية إلى ملف مجموعات عينة كبيرة لمستويات التعبير ميرنا ، حتى مع محدودية المواد البداية.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر مختبر Blelloch عن التعليق على النص. وأيد هذا العمل من جانب صناديق لRB من المعاهد الوطنية للصحة (K08 NS48118 وNS057221 R01) ، معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (المنحة البذور RS1 – 00161 ، ونيو جائزة كلية RN2 – 00906) ، وصندوق بيو الخيرية وزير الخارجية من Wissenschaftlich Urologische غزلشافت فولت.