In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

1. In Vitro biofilmvorming Bacteriekolonies (die zijn gekweekt op juiste agar 's nachts), werden opgeschort in de media en de OD 490 is aangepast aan 0,65 De resulterende bacteriële suspensie werd vervolgens verdund 01:06 (1 ml bacteriesuspensie + 5 ml voorverwarmd medium) en geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO 2 voor ongeveer 3 uur om de mid-log-fase te bereiken. Verdun de mid-log groei ophanging 1:2500 met voorverwarmd media en plaats 200 pi van de verdunning in elke well van een 8-well kamer glijbaan. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2. Na ongeveer 16 uur, aspireer medium van de hoek van elke kamer en voeg 200 pi verse, voorverwarmde medium – afzien langs de muur van de kamer, zodat er geen afschuifkrachten te creëren in de kamer die de biofilm kunnen verstoren. Als het incuberen van langer dan 24 uur, veranderen medium elke 12 uur of als nodig is om bacteriële levensvatbaarheid te behouden. 2. Visualisatie van Biofilm Aspireren medium van elke kamer, zoals hierboven beschreven, en was woonachtig biofilm twee keer voorzichtig met een steriele zoutoplossing. Voeg 200 ul van BacLight Live / Dead vlek (3 pL component A + 3 pi component B per ml zout) aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Bescherm de cultuur van het licht vanaf dit punt verder. Aspireren de vlek en voorzichtig twee keer wassen met steriele zoutoplossing als voorheen. Voeg 200 ul van neutraal gebufferde formaline in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur monster op te lossen. Verwijder fixatief en correct in de afvoer in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Was tweemaal met zout en gooi de was vloeistoffen die bevatten formaline als hierboven. Verwijder het plastic putten uit de dia, voeg genoeg zout in elk putje, zodat wanneer een dekglaasje wordt geplaatst op de pakking, geen luchtbellen aanwezig zijn. Dekglaasje en afdichting van de randen van het dekglaasje met montage medium. Nagellak kunnen gebruikt worden om de dia's zegel echter de dia's worden niet als permanente. Laat de kit vooraf drogen ongeveer 1 uur tot het onderzoek via microscopie. 3. Resultaten Figuur 1. Vertegenwoordiger 3D samengestelde beelden van een biofilm gevormd in een 8-well kamer schuiven. Bacteriën werden gemerkt met Live / Dead beits, waarin levende bacteriën fluoresceren groene en dode bacteriën rood fluoresceren. (A) Composiet beeld van de gehele biofilm met verschillende architectuur met torens en water kanalen. (B) Zelfde biofilm als in (A), nu gezien in dwarsdoorsnede.