Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay
Summary
Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.
Abstract
In Säugetieren wirkt Stammzellen als Quelle von undifferenzierten Zellen zu Zelle Entstehung und Erneuerung in verschiedenen Geweben und Organen während der Lebensdauer des Tieres zu erhalten. Sie können möglicherweise ersetzen Zellen, die in den Alterungsprozess oder in den Prozess der Verletzungen und Krankheiten verloren gehen. Die Existenz von neuralen Stammzellen (NSCs) wurde zuerst von Reynolds und Weiss (1992) in der erwachsenen Säugetieren zentralen Nervensystems (ZNS) mit einem neuartigen serumfreien Kultur-System, das Neurosphäre Assay (NSA) beschrieben. Unter Verwendung dieses Tests ist es auch möglich zu isolieren und zu erweitern NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS. Diese in vitro erweitert NSCs sind multipotente und kann zu den drei wichtigsten Zelltypen des ZNS geben. Während die NSA scheint relativ einfach durchzuführen, um die Verfahren demonstriert hier Aufmerksamkeit erforderlich ist, um verlässliche und konstante Ergebnisse zu erzielen. Dieses Video zeigt praktisch NSA zu erzeugen und zu erweitern NSCs aus embryonalen Tag 14-Maus-Gehirngewebe und erbringt technische Details so dass man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen. Das Verfahren schließt die Gewinnung E14 Mausembryonen, Gehirn Mikrodissektion zu den Ganglien-Eminenzen, Dissoziation des geernteten Gewebes in NSC Medium Ernte einer einzigen Zellsuspension zu gewinnen, und schließlich plating Zellen in NSA Kultur. Nach 5-7 Tagen in Kultur, sind die resultierenden primären Neurosphären passagiert weiter ausbauen die Anzahl der NSCs für zukünftige Experimente.
Protocol
Discussion
Die Neurosphäre Test ist die Methode der Wahl für die Isolierung und Expansion von neuralen Stammzellen 1-5 wegen seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit. Dieser Assay ist ein unschätzbares Werkzeug für Großanlagen von undifferenzierten Vorläuferzellen ZNS, die sowohl für in vitro und in vivo-Studien verwendet werden könnte. Es sollte betont werden, dass Neurosphären sowohl von der bona fide neuralen Stammzellen und mehr eingeschränkt Vorfahren konnten generiert werden kann. Dahe…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Foundation unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Referencias
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
