Summary

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Published: November 20, 2010
doi:

Summary

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة الفحص neurosphere لتوليد وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه.

Abstract

وكان أول وصف العزلة والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية المفترضة (NSCs) من دماغ الفئران رينولدز الكبار بحلول عام 1992 وايس توظيف المعرفة كيميائيا منظومة الثقافة المصل الحرة المعروفة باسم مقايسة neurosphere (NSA). في هذا الاختبار ، فإن غالبية أنواع الخلايا المتمايزة تموت في غضون بضعة أيام للثقافة ولكن مجموعة صغيرة من الخلايا السليفة عامل النمو استجابة الخضوع الانتشار النشط في وجود عامل نمو البشرة (EGF) و / عامل النمو الأساسي ليفية (bFGF). هذه الخلايا شكل مستعمرات خلايا غير متمايزة تسمى neurospheres ، والذي بدوره يمكن subcultured توسيع مجموعة من الخلايا الجذعية العصبية. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا للتمييز الخلايا ، توليد ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي أي ، النجمية ، وoligodendrocytes. هذا الاختبار يوفر أداة لا تقدر بثمن لتوريد متناسقة ، مصدر متجدد السلائف CNS غير متمايزة ، والتي يمكن استخدامها في المختبر في الدراسات ، وكذلك لأغراض علاجية.

هذا الفيديو يوضح طريقة لإنشاء وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من المنطقة المحيطة بالبطين الماوس الكبار ، ويقدم رؤى التقنية لضمان تحقيق الثقافات يمكن لأحد أن neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد الدماغ من الماوس الكبار ، والتشريح الدقيقة في المنطقة المحيطة بالبطين ، وإعداد الأنسجة والثقافة في وكالة الامن القومي. هو أول الأنسجة التي تحصد هضمها كيميائيا باستخدام التربسين – EDTA ثم فصلها آليا في مجلس الأمن القومي لتحقيق المتوسطة تعليق خلية واحدة ومطلي أخيرا في وكالة الامن القومي. بعد 7-10 أيام في الثقافة ، مما أدى neurospheres الأولية مستعدون للثقافة فرعية للوصول الى كمية من الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب في المستقبل.

Protocol

<p class="jove_title"> الجزء 1 : عاديه إعداد قبل الشروع في تشريح :</p><ol><liمستعد> متوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي. ويمكن أيضا أن يكون مجلس الأمن القومي المتوسطة المحرز في المختبر ، استنادا للنمو تشكيل مجلس الأمن ال?…

Discussion

اكتسبت مقايسة neurosphere 2 اهتماما واسعا في الأوساط البحثية ، ليس فقط لعزل ودراسة الجهاز العصبي المركزي من NSCs 4-5 ولكن أيضا لعزل أنواع أخرى من الخلايا الجذعية من الأنسجة المفترضة عديدة ، مثل سرطان الثدي والقلب 6 7 و للتعرف على سرطان الثدي والمخ والخلايا ال?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700  
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701  
%0.05 trypsin-EDTA Reagent Gibco 25300-062  
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma T6522  
Cell strainer Sieve BD Falcon 352340  
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196  
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905  
EGF Growth factor R&D 2028-EG  
Pen/Strep Reagent Gibco 15140-122  
*MEM Reagent Gibco 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma H4034 HEM component
*Distilled water Reagent Gibco 15230-147  
15 ml tubes Culture ware BD Falcon 352096  
50 ml tubes Culture ware BD Falcon 352070  
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35  
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30  
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10  
b-FGF Growth factor R&D 3139-FB  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

Referencias

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
  4. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  6. Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  7. Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  8. Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
  9. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).

Play Video

Citar este artículo
Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).

View Video