הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).
תאים של חיידקים רבים יש את היכולת ליצור קהילות מיקרוביאלי נייחים כהגדרתו biofilms כי שינו תכונות פיזיולוגיות פתולוגי לעומת מיקרואורגניזמים שחיים חינם. Biofilms בטבע הם לעתים קרובות קשה לחקור מתגוררים תחת תנאים מוגדרים היטב 1. באמצעות תשתית שקוף זה אפשרי למכשיר מערכת שבה biofilms פשוטה ניתן לבדוק באופן בלתי הרסניות בזמן אמת: כאן אנו מדגימים את הרכבה והפעלה של מערכת התא זרימה מודל, עבור במבחנה 3D של biofilms חיידקים יצירת reproducibility גבוהה תחת תנאים מוגדרים היטב 2,3.
המערכת כוללת תא זרימה המשמש חדר הצמיחה biofilm. התא זרימה מסופק עם חומרי מזון וחמצן מן הבקבוק בינוני באמצעות משאבה peristaltic ובינוניים בילה נאסף במיכל אשפה. זה בנייה של מערכת הזרימה מאפשר אספקה רציפה של חומרים מזינים מתן אנטיביוטיקה למשל עם הפרעה מינימלית של תאים בוגרים בחדר זרימה. יתר על כן, תנאי הזרימה בתוך התא זרימה לאפשר מחקרים biofilm שנחשפו ללחץ גזירה. בועה השמנה גבולות מכשיר בועות אוויר מן הצינור, אשר אחרת עלולה לשבש את המבנה biofilm בתוך התא זרימה.
מערכת התא זרימה תואמת מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) והוא יכול ובכך לספק מידע 3D מפורט ביותר על פיתוח biofilms חיידקים. תאים biofilm יכול להיות מתויג עם בדיקות ניאון או חלבונים בקנה אחד עם ניתוח CLSM. זה מאפשר הדמיה מקוונת המאפשרת חקירת נישות biofilm המתפתח. הגומלין מיקרוביאלית, חקירת סוכני מיקרוביאלית או את הביטוי של גנים ספציפיים, הם של ניסויים רבים setups שניתן לחקור במערכת התא זרימה.
אנחנו הוכיחו תא זרימה מערכת המייצגת כלי רב עוצמה בחקירות biofilm. בשילוב עם הדמיה 3D ידי מיקרוסקופיה confocal, המערכת מציעה מגוון יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של ניתוח biofilms חיידקים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות מסורתיים יותר. מערכת זו מאפשרת הדמיית 3D של חיים מיקרוביאליים קהילות biofilm ללא הפרעה של הקהילה. במיקרוסקופ אור לא תספק מידע מפורט על נישות של biofilm ובעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מספקת רזולוציה ננומטרי של biofilm, הוא אינו מאפשר הדמיה תא חי.
באמצעות ערוץ המתואר זרימת מערכת הובהר לנו בעבר את הפריסה המרחבית של תאים חיידקיים רגיש לאנטיביוטיקה מספר 5-8 (איור 4 א), הפצה של חומרים תאיים, למשל DNA ו 9-11, חלוקת תאים ניעתי ולא ניעתי של מאותו המין בתוך קהילה חיידקי 4,6,9 (איור 4 ג'). אנו צופים כי המערכת התא זרימה ניתן ללמוד היבטים של biofilms שמרים. זה עשוי להיות הפצה spatio הזמני של biofilm שמרים בתגובה גורמים סביבתיים כמו קוטלי פטריות, וכן זיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות biofilm שמרים. למרות שמרים לא ידוע להתמיין לתאי ניעתי ולא ניעתי, היבטים אחרים של גיוון עשוי להיות biofilm מחקרים כגון השינוי המורפולוגי של שמרים לתאי pseudohyphal ואת המעבר הפלואידים לתאי דיפלואידי.
הראינו מערכת לציית מינים של חיידקים כמה יעבוד עם טכניקות צביעה שונות. מגוון בדיקות מכתים שונים חלבוני ניאון, כגון ה-GFP, לאפשר חקירות נישה ספציפיים biofilm המתפתח והוא מהווה כלי יעיל בניתוח ההשפעה של סוכני מיקרוביאלית או גורמים סביבתיים אחרים. המידע ניתן להשיג מפורט מאוד (איור 4) ותכונות biofilm ניתן לכמת עם תוכנות מחשב כגון סטטמ"מ 12,13.
בסך הכל, ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול היא העובדה כי זהו תהליך גוזל זמן. זה גם מגבלה כי התאים צריכים להיות מסוגלים לגדול על משטח שאינו פלורסנט שקוף. . מכיוון biofilm נוצר מנותח באמצעות מיקרוסקופ confocal, עומק שניתן לחקור מוגבלת מאה מיקרומטר מספר 14 יש עוד מגבלות טכניות הטמון בעיצוב: המערכת אינו מתאים להקרנה תפוקה גבוהה, כחוקר מנוסה יכול לטפל בכ 15 ערוצי ביותר בכל ניסוי, אשר בתורו יכול לקחת כמה ימים כדי להתכונן. עם זאת, אנטיביוטיקה או מוטציות שנחשבים רלוונטיים ללימודי biofilm יכולים בתחילה להיות מסה הוקרן עם שיטות אחרות כגון מכתים סגול גביש לפני המועמדים המעניינים ביותר מועברים למערכת התא זרימה. יריעות כיסוי זכוכית דקים מאוד לשבור בקלות, יש להיזהר בעת הטיפול במערכות. בנוסף צינורות יש לבחון מדי יום במהלך הריצה של ניסוי, כמו רב "גב צמיחה" של צינורות כניסת רק נגד הזרם של תאים זרימת יכול להתרחש. זיהום מסוג זה ניתן לפתור על ידי הסרת כמה סנטימטרים של צינור סיליקון מהצד מפרצון של תאים הזרימה, באמצעות טכניקה סטרילית.
איור 4 PAO1 הישן) יום 4 -. Biofilm GFP שטופלו במשך 24 שעות עם Colistin ו יודיד Propidium עבור מכתים מת (כתם אדום) ב) מצגת 3D של יום שלוש פ 'הישן aeruginosa PAO1 (סוג P. aeruginosa בר) – GFP biofilm 6 ג) 3D מצגת תמונה של PAO1 – CFP Pila מוטציה (כחול) עם PAO1 סוג YFP בר (צהוב) ד) 5, יום PAO1 בן – GFP biofilm כפי שהוצגו 3D דואר תמונה) 26 ש 'ח (PTR3 מוטנטי CEN.PK רקע) biofilm cerevisiae מוכתם Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |