Deze procedure laat de zuivering van DNA-fragmenten met een hoog rendement.
Gezuiverde DNA-fragmenten worden gebruikt voor verschillende doeleinden in Moleculaire Biologie en ze kunnen worden bereid door verschillende procedures. De meesten van hen vereisen een eerdere elektroforese van de DNA-fragmenten, om de band van belang te scheiden. Dan is deze band weggesneden uit een agarose-of acrylamide gel en gezuiverd door middel van: binding en elutie van glazen of silica deeltjes, DEAE-cellulose membranen, "crush en genieten methode", elektro of heel vaak dure commerciële zuivering kits. Zo zal het selecteren van een methode grotendeels afhankelijk zijn van wat er beschikbaar is in het laboratorium. De elektro-procedure maakt het mogelijk om te zuiveren zeer schoon DNA te worden gebruikt in een groot aantal toepassingen (sequencing, radiolabeling, enzymatische beperking, enzymatische modificatie, klonen etc). Deze procedure bestaat uit het plaatsen van DNA-band-bevattende agarose of acrylamide sneetjes in monster putjes van de electroeluter, dan is toepassing van de huidige zal het DNA-fragment op de agarose te verlaten en dus gevangen in een kussen zout zijn om later worden teruggevorderd door ethanolprecipitatie.
De duur van de termijn zal sterk afhangen van de grootte van de fragmenten, die normaal voor de fragmenten van maximaal 20 kb 50 minuten tot 1 uur is genoeg, terwijl voor kleine fragmenten UV-licht controle op elke 10 minuten is vereist om het fragment te voorkomen om door de zout kussen en bijgevolg de anodal buffer kamer afnemende herstel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat wanneer u uw voeding op 100 volt, is er een stroom van ten minste 10 MAMP. De DNA-band kan worden gecontroleerd met behulp van een UV-lamp en de hand detecteren wanneer dit verlaat de gel slice. Het kussen zout kan ook gemaakt worden met 3 M Na-acetaat.
Deze procedure laat de zuivering van DNA of RNA-fragmenten van verschillende afmetingen met een goede recovery (~ 80%), voor radioactief, verteerd door restrictie-enzymen, verwerkt door aanpassing van enzymen, etc.
The authors have nothing to disclose.
Werk in Dr Bermudez laboratorium werd gefinancierd door Conacyt (Grant # 82622). Wij danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez en Ximena Rodriguez-Torres voor video-opname van de electroleution procedure.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NdeI | New England Biolabs | R0111L | ||
HindIII | New England Biolabs | R0104L | ||
NH4 acetate | JTBaker | 0596 | ||
agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | ||
Electroeluter | IBI | UEA CAT 46000 |