Summary

Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco

Published: August 14, 2010
doi:

Summary

Questo protocollo comporta un non radioattivo<em> In situ</emIbridazione> procedura che consente l'identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.

Abstract

Qui si descrive una versione modificata di una fluorescenza doppio<em> In situ</emIbridazione> (dFISH) metodo ottimizzato per il rilevamento di due mRNA di interesse fresco sezioni cervello congelato. Il nostro gruppo ha utilizzato con successo questo approccio per lo studio genetico di co-regolamentazione. Più in particolare, abbiamo utilizzato questo metodo dFISH per esplorare l'organizzazione anatomica, le proprietà neurochimiche, e l'impatto dell'esperienza sensoriale nel centro di circuiti sensoriali, a risoluzione singola cellula. Questo protocollo è stato convalidato nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma dovrebbe essere facilmente adattabile alle altre specie di vertebrati, come pure una serie di non-tessuti neurali. In questo film ci fornisce una dimostrazione dettagliata delle tappe principali di questa procedura.

Protocol

Questo protocollo è stato sviluppato e raffinato basato sullo standard radioattivi e non radioattivi in situ metodi di ibridazione, in precedenza sviluppato da noi e gli altri di individuare uno o due specie di trascrizione nel tessuto cerebrale 1-7. Il protocollo descritto di seguito ha una lunghezza totale di 2 o 3 giorni, a seconda del numero di interruzioni procedurale scelto dall'utente finale. Tutti i passaggi dettagliati di seguito sono essere condotte a temperatura ambiente, con l'ec…

Discussion

Abbiamo usato questo protocollo per studiare come il cervello dei vertebrati è neurochemically e funzionalmente organizzato, e per determinare come comportamentale rilevante per l'impatto sensoriale stimoli il meccanismo genomico dei neuroni nel cervello adulto 8-10. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma prevediamo che questo protocollo sarà facilmente adattabile alle sezioni del cervello ottenute da una serie di specie di vertebrati e, f…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lavoro sostenuto dalle concessioni di NIH / dell'NIDCD e la Fondazione Schmitt a RP.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
DEPC   VWR IC15090225 toxic substance
PCR purification kit   QIAgen 28104  
Formaldehyde   VWR BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase   Roche 11031163001  
T7 RNA polymerase   Roche 10881767001  
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)   VWR IC816124  
MgCl2 (1 M)   Sigma 449172  
Spermidine (1 M)   Sigma S0266  
DIG RNA labeling mix   Roche NC9380805  
Biotin RNA labeling mix   Roche NC9440104  
RNasin   Promega N2111  
BSA   Sigma 05491  
DTT   Sigma D5545  
Sephadex G50   VWR 95016-772  
EDTA   VWR 101384-758  
SDS   Sigma L4390  
Transfer (t)RNA   Invitrogen 15401011  
10X MOPS   VWR 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde   VWR AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic   Sigma S3139  
Sodium phosphate dibasic   Sigma S3264  
NaOH   VWR SX0600-1  
Triethanolamine   VWR IC15216391  
Acetic anhydride   VWR MK242002 toxic substance
SSPE   VWR 82021-488  
Formamide   VWR JT4028-1 toxic substance
Poly A   Invitrogen POLYA.GF  
Mineral oil   VWR IC15169491  
Chloroform   VWR BDH1109 organic solvent
Deionized formamide   Sigma F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide   VWR VW36901 toxic substance
Tween 20   Sigma P1379  
Triton X-100   J. T. Baker X198-05  
Anti-DIG HRP   Roche 11093274910  
Anti-biotin peroxidase   Vector SP3010  
TSA Alexa Fluor 594   Invitrogen T20935  
TSA Alexa Fluor 488   Invitrogen T20932  
Hoechst   VWR 200025-538  
Vectashield   Vector H-1000  
embedding mold   VWR 15160-157  
cryostat   Leica CM 1850  
Superfrost plus slide   VWR 89033-052  

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

Referencias

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Citar este artículo
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

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