Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties
Summary
Dit protocol betreft een niet-radioactieve<em> In-situ</em> Hybridisatie procedure dat de gelijktijdige identificatie van twee transcript soorten mogelijk maakt, op een enkele cel resolutie, in dunne delen van de gewervelde hersenen.
Abstract
Hier beschrijven we een aangepaste versie van een dubbele fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie (dFISH) methode geoptimaliseerd voor het detecteren van twee mRNA's van de interesse in vriesverse hersenen secties. Onze groep heeft met succes gebruik gemaakt van deze aanpak van de gen co-regulering te bestuderen. Meer specifiek, hebben we gebruik gemaakt van deze dFISH methode om de anatomische organisatie, neurochemische eigenschappen en de impact van de zintuiglijke ervaring in het centrum van zintuiglijke circuits te verkennen, op enkele cel resolutie. Dit protocol is gevalideerd in het hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar zal naar verwachting worden eenvoudig aan te passen aan andere gewervelde diersoorten, alsmede op een array van niet-neurale weefsels. In deze film geven we een gedetailleerde demonstratie van de belangrijkste stappen van deze procedure.
Protocol
Discussion
Wij hebben gebruik gemaakt van dit protocol te onderzoeken hoe de gewervelde hersenen neurochemisch en functioneel georganiseerd, en hoe gedragsmatig-relevante zintuiglijke prikkels invloed hebben op de genomische machinerie van neuronen in het volwassen brein 80-10 te bepalen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode in hersenweefsel van muizen, ratten en zangvogels, maar verwachten dat dit protocol zal worden eenvoudig aan te passen aan de hersenen verkregen na een reeks van gewervelde soorten …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk ondersteund door subsidies van het NIH / NIDCD, toont en de Schmitt Stichting RP.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
| PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
| Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
| DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
| Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
| RNasin | Promega | N2111 | ||
| BSA | Sigma | 05491 | ||
| DTT | Sigma | D5545 | ||
| Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
| EDTA | VWR | 101384-758 | ||
| SDS | Sigma | L4390 | ||
| Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
| 10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
| Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
| NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
| SSPE | VWR | 82021-488 | ||
| Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
| Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
| Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
| Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
| Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
| Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
| TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
| TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
| Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
| cryostat | Leica | CM 1850 | ||
| Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions
- Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
- Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
- TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
- TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
- TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
- Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
- Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
Referencias
- Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
- Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
- Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
- Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology–a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
- Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
- Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
- Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
- Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain’s response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
- Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
- Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
- Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
- Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).
