Summary

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Published: August 14, 2010
doi:

Summary

هذا البروتوكول ينطوي على غير المشعة<em> في الموضع</em> إجراء التهجين التي تمكن من تحديد وقت واحد من الأنواع النص الثاني ، في قرار خلية واحدة ، في أقسام المخ رقيقة من الفقاريات.

Abstract

نحن هنا تصف نسخة معدلة من مضان مزدوجة<em> في الموقع</em> التهجين (dFISH) الأسلوب الأمثل للكشف عن two mRNAs الفائدة في أقسام المخ الطازجة المجمدة. وقد استخدمت بنجاح مجموعتنا هذا النهج لدراسة الجينات المشتركة والقوانين. بشكل أكثر تحديدا ، وقد استخدمنا هذا الأسلوب dFISH لاستكشاف منظمة التشريحية والخصائص الكيميائية العصبية ، وتأثير التجربة الحسية في الدوائر المركزية الحسية ، في قرار خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول في أنسجة المخ من الجرذان والفئران والطيور المغردة لكن من المتوقع أن تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى الأنواع الفقارية الأخرى ، فضلا عن مجموعة من الأنسجة غير العصبية. في هذا الفيلم يقدم لنا دليلا مفصلا للخطوات الرئيسية لهذا الإجراء.

Protocol

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وصقلها على أساس معيار المشعة وغير المشعة طرق التهجين في الموقع ، وضعت مسبقا من قبلنا وغيرها للكشف عن الأنواع نص واحد أو اثنين في أنسجة الدماغ 1-7. البروتوكول هو موضح أدناه وبطول إجمالي يبلغ 2 أو 3 أيام ، اعتمادا على عدد من انقطاع ال?…

Discussion

وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة كيفية تنظيم neurochemically وظيفيا في المخ الفقاريات ، وتحديد كيفية تأثير سلوكيا ذات الصلة المحفزات الحسية من آلات الجيني للخلايا العصبية في الدماغ البالغ 80-10. وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح في أنسجة المخ من الجرذان والفئران والطيو…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

العمل بدعم من المنح من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCD ومؤسسة شميت لRP.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
DEPC   VWR IC15090225 toxic substance
PCR purification kit   QIAgen 28104  
Formaldehyde   VWR BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase   Roche 11031163001  
T7 RNA polymerase   Roche 10881767001  
Tris-HCl (1 M, pH 7.5)   VWR IC816124  
MgCl2 (1 M)   Sigma 449172  
Spermidine (1 M)   Sigma S0266  
DIG RNA labeling mix   Roche NC9380805  
Biotin RNA labeling mix   Roche NC9440104  
RNasin   Promega N2111  
BSA   Sigma 05491  
DTT   Sigma D5545  
Sephadex G50   VWR 95016-772  
EDTA   VWR 101384-758  
SDS   Sigma L4390  
Transfer (t)RNA   Invitrogen 15401011  
10X MOPS   VWR 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde   VWR AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic   Sigma S3139  
Sodium phosphate dibasic   Sigma S3264  
NaOH   VWR SX0600-1  
Triethanolamine   VWR IC15216391  
Acetic anhydride   VWR MK242002 toxic substance
SSPE   VWR 82021-488  
Formamide   VWR JT4028-1 toxic substance
Poly A   Invitrogen POLYA.GF  
Mineral oil   VWR IC15169491  
Chloroform   VWR BDH1109 organic solvent
Deionized formamide   Sigma F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide   VWR VW36901 toxic substance
Tween 20   Sigma P1379  
Triton X-100   J. T. Baker X198-05  
Anti-DIG HRP   Roche 11093274910  
Anti-biotin peroxidase   Vector SP3010  
TSA Alexa Fluor 594   Invitrogen T20935  
TSA Alexa Fluor 488   Invitrogen T20932  
Hoechst   VWR 200025-538  
Vectashield   Vector H-1000  
embedding mold   VWR 15160-157  
cryostat   Leica CM 1850  
Superfrost plus slide   VWR 89033-052  

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

Referencias

  1. Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
  2. Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
  3. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
  4. Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology–a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
  5. Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
  6. Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
  7. Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
  8. Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain’s response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
  9. Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
  10. Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
  11. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

Play Video

Citar este artículo
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

View Video