Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

I. Hücre izci CMFDA ve CMRA hücreleri yükleme Fare melanom hücre hattı (B16-F1) önceden hazırlanmış hücreleri üzerinde deneyler yapıldı. Hücreler% 70-80% 10 fetal sığır serumu, 0.15 mg / ml 'lik L-glutamin, 16 mg ile desteklenmiş DMEM kültür ortamı izdiham (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta) için iki ayrı 25 cm 2 kültür şişeler (DYP, ZDA ) yetiştirilen / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Almanya), 200 adet / ml crystacillin (Pliva'nın Hırvatistan), 37% 5 CO 2 inkübe ° C Orijinal boya 50 mikrogram 10.76 ul ul ve DMSO (Sigma-Aldrich, Almanya) 9 (sırasıyla, Yeşil CMFDA ve Turuncu CMRA) ekleyerek iki Hücre izci 10 mM stok solüsyonları (Invitrogen, ABD) hazırlayın Invitrogen flakon. Stok çözelti 4 ° C'de birkaç ay buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar, deneyler başlamadan önce ısınmak çözüm. Bikarbonat-Krebs-HEPES tamponu (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 mM D-glukoz, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.4) hazırlayın. Iki bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu 3 ml 15 ml Eppendorf tüpleri ayrı ayrı her bir stok solüsyonu 2.1 ul karışımı (10 mM CMFDA veya CMRA, sırasıyla). Bu yaklaşık çalışmada 7 mcM CMFDA (ya da CMRA) içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır. Bikarbonat ücretsiz Krebs-HEPES tamponu ile hücreler iki kez durulayın ve sonra şişeler içine çözümler yükleme eklemek. 37% 5 CO 2, 30 dakika boyunca hücrelerinin inkübe ° C. Bu ilk kuluçka reaktifleri hücre zarları aracılığıyla serbestçe geçiş sırasında, ama bir kez hücre içinde, reaktifler hücre geçirgenliği olmayan floresan reaksiyon ürünler haline dönüştürülür. 37 ilk inkübasyondan sonra, durulama ve% 5 CO 2, iki saat boyunca başka bir kültür ortamı ile hücreleri inkübe ° C Hem şişeler hücrelerin Trypsinize (CMFDA ve CMRA yüklü) ve 50 ml santrifüj tüpüne bir oranı 1:1 (DYP, ZDA) birlikte, kırmızı ve yeşil hücreleri karışımı. DMEM orta ile seyreltme veya santrifüj ile konsantrasyon 5 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. 24 multiwell plaka (DYP, ZDA) her kuyuda bir hücre süspansiyonu 20 ul damla yerleştirin. 37 ° C'de 20 dakika için onları biraz daha iyi yüzeyine tutunur ve hücre temas kurmak için izin vermek için% 5 CO 2 hücre inkübe edin. II. Elektrofüzyon (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 75 mM sukroz) isoosomolar potasyum fosfat tamponu hazırlayın (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, 250 mM sukroz) ve hypoosmolar potasyum fosfat tamponu . Iyi altındaki hücreleri mikroskop aşamada, pozisyon üzerine elektrotlar multiwell yerleştirin ve darbe jeneratörü bağlayın. Isoosomolar potasyum fosfat tamponu 1 ml hücreleri yıkayın. Hücre şişmesi neden için 350 ul hypoosmolar potasyum fosfat tamponu ekleyin. Tampon elektrotlar kapsamalıdır. Hücreleri elektrik darbeleri uygulamadan önce 2 dakika hypoosmolar tampon içinde bırakın. Osmotik hücrelerinin iç ve dış arasındaki dengesizlik nedeniyle hücre içine su molekülleri bu kez akını sırasında hücre hacmi bir artışa neden olur. Hücreler maksimum hacim yakın Elektrik bakliyat düzenleyici seviyesini azaltmak başlamadan önce uygulanmalıdır. Optimal elektrofüzyon ulaşmak ve hücre canlılığını korumak için, elektrik darbeleri optimal parametreleri kullanılmalıdır. Bunlar [1] kullanılan hücre hattı bağlıdır. Bu deneyde, 8 dikdörtgen darbeler (1 Hz 100 s süresi her) bir tren elektroporasyon cihazı (bizim durumumuzda Cliniporator, Igea, İtalya) ile, her bir örnek uygulanır. Darbeleri iyi kontrolü dışında, bir elektrik alanı, her bir kuyunun elektrot arasındaki yaklaşık 1200 V / cm, 0.8 mm çap ve aralarında 5 mm mesafe ile iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir. 10 dakika sonra nabız teslimat için rahatsız hücreleri bırakın. Floresan, faz kontrast mikroskobu ile füzyon verimi belirleyin. III. Görüntü edinimi ve füzyon verimi belirlenmesi Hücreleri bir amacı (x20) ve soğutmalı CCD kamera (VisiCam 1280, Visitron, Almanya) ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak görülmektedir. Görüntüleri MetaMorph 7.1.1 (Moleküler Cihazlar, ABD) satın alınan, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. CMFDA 548 nm'de 492 nm'de monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve CMRA heyecanlı. CMFDA ve CMRA floresan (D605/55m C iki emisyon 535 nm 'de merkezlenmiş filtreler, bir (HQ535/30m CMFDA için) ve 510 nm dalga boyunda diğer merkezli kullanarak elde edilirMRA, Chroma, ABD) hem de. Dikroik ayna (Q515LP) kanal çapraz tartışma engelledi. Her iyi beş rasgele seçilmiş alanlar için üç görüntüleri (faz kontrast, kırmızı ve yeşil floresan) edinin. Her görüntünün üçlü üç kanal görüntüleri oluşturun. Böyle bir görüntüde floresanlama sitoplazma, hücre zarları ile birlikte görülebilir. Sigortalı hücreleri böylece [Şekil 1] kolayca tespit edilebilir. Her üç kanallı görüntü her üç tip hücre (kırmızı, yeşil ve dually floresan) güvenin. Her görüntünün tüm hücrelerin sayısı ile ikili olarak floresan hücrelerinin sayısına bölünmesiyle dually floresan hücrelerin yüzdesi belirleyin. Fusion verim yarısı erimiş hücreler tespit olmadığı için 2 ile çarpılır dually floresan hücrelerin yüzdesi olarak tanımlanır (aynı renk sigorta hücreleri). Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 elektrofüzyon sonra B16F1 hücrelerinin üç kanal mikroskopi görüntü: faz kontrast, CMRA floresan (548 nm eksitasyon) ve CMFDA floresans (492 nm eksitasyon), objektif büyütme 20x