Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

I. Het laden van de cellen met Cell trackers CMFDA en CMRA Experimenten werden uitgevoerd op vooraf bereide cellen van muizen melanoom cellijn (B16-F1). Cellen worden gekweekt in twee gescheiden 25 cm 2 cultuur flessen (TPP, ZDA) tot 70-80% confluentie in DMEM kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,15 mg / ml L-glutamine, 16 mg / ml gentamicine (alle van Sigma-Aldrich, Duitsland), 200 eenheden / ml crystacillin (Pliva, Kroatië), en geïncubeerd in 5% CO 2 bij 37 ° C. Bereid twee 10 mM voorraad oplossingen van Cell trackers (Invitrogen, USA) door het toevoegen van 10,76 pl en 9 ul (voor Groen CMFDA en voor Orange CMRA, respectievelijk) van DMSO (Sigma-Aldrich, Duitsland) tot 50 ug van de kleurstof in de oorspronkelijke Invitrogen flacon. De voorraad-oplossing kan worden opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C voor enkele maanden. Voordat u begint met de experimenten, warming-up van de oplossing tot de kristallen van DMSO op te lossen. Bereid bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4). In twee 15 ml Eppendorf-buisjes apart mix 2,1 pi van elk bestand oplossing (10 mM CMFDA of CMRA, respectievelijk) in 3 ml bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer. Dit levert een "laad-oplossing" met ongeveer 7 uM CMFDA (of CMRA). Twee keer Spoel cellen met bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer en steek laad-en lossystemen in de kolven. Incubeer cellen gedurende 30 minuten in 5% CO 2 bij 37 ° C. Tijdens deze eerste incubatie reagentia passeren vrij door celmembranen, maar eenmaal binnen de cel, worden de reagentia omgezet in cell-impermeant fluorescerende reactieproducten. Na de eerste incubatie, spoelen en cellen met voedingsbodem voor nog eens twee uur in 5% CO 2 incuberen bij 37 ° C. Trypsinize cellen in beide kolven (geladen met CMFDA en CMRA) en mengen rode en groene cellen in een verhouding 1:1 in een centrifugebuis van 50 ml (TPP, ZDA). Stel cel concentratie 5 x 10 6 cellen / ml door verdunning met DMEM medium of door concentratie met centrifuge. Plaats een 20 pl druppel celsuspensie in elk putje van 24 multiwell plaat (TPP, ZDA). Incubeer cellen in 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 20 minuten, zodat ze iets hechten aan het oppervlak van de put en cel contacten te leggen. II. Elektrolassen Bereid isoosomolar kaliumfosfaatbuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM sucrose) en hypoosmolar kaliumfosfaat buffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 75 mM sucrose) . Plaats de meerdere venstertjes met cellen op de microscoop podium, plaatst de elektroden op de bodem van de put en sluit ze aan op de pulsgenerator. Was de cellen met 1 ml van isoosomolar kaliumfosfaat buffer. Voeg 350 ul van hypoosmolar kaliumfosfaat buffer om de cel zwelling induceren. De buffer moet betrekking hebben op de elektroden. Laat cellen in hypoosmolar buffer gedurende 2 minuten voor het aanbrengen van elektrische pulsen. Gedurende deze tijd toevloed van water moleculen in de cellen als gevolg van osmotische evenwicht tussen de binnenkant en de buitenkant van de cellen veroorzaken een toename van cell volume. Elektrische pulsen moeten worden toegepast wanneer de cellen dicht bij hun maximale volumes, voordat de regelgeving volume te verlagen starten. Om een ​​optimale electrofusie bereiken en te handhaven levensvatbaarheid van de cellen zijn, moeten optimale parameters van elektrische pulsen worden gebruikt. Deze zijn afhankelijk van cellijn gebruikt [1]. In dit experiment een trein van 8 rechthoekige pulsen (elk met een duur van 100 microseconden bij 1 Hz) wordt toegepast op elk monster, met behulp van elektroporatie apparaat (in ons geval Cliniporator, IGEA, Italië). De pulsen worden geleverd aan twee parallelle Pt / Ir draadelektroden met 0,8 mm diameter en 5 mm afstand tussen hen, het creëren van een elektrisch veld van ongeveer 1200 V / cm tussen de elektroden in elk putje, behalve voor de controle goed. Laat de cellen ongestoord gedurende 10 minuten na de puls levering. Bepaal de fusie opbrengst door middel van TL-en fase-contrast microscopie. III. Beeldacquisitie en bepaling van de fusie opbrengst De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentie microscoop (in ons geval Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Duitsland) zijn uitgerust met een objectief (x20) en een gekoelde CCD-camera (VisiCam 1280, Visitron, Duitsland). De beelden worden verkregen in Metamorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), maar ook andere soortgelijke acquisitie software kan ook worden gebruikt. CMFDA is opgewekt met een monochromator (Polychrome IV, Visitron, Duitsland) bij 492 nm en 548 nm CMRA op. De fluorescentie van CMFDA en CMRA wordt verkregen met behulp van twee emissie-filters, een gecentreerd op 535 nm (HQ535/30m voor CMFDA) en de andere gecentreerd op 510 nm (D605/55m, voor CMRA, beide Chroma, USA). Het gebruik van dichroïsche spiegel (Q515LP) voorkomen dat het kanaal overspraak. Acquire drie foto's (fase contrast, rode en groene fluorescentie) voor vijf willekeurig gekozen velden in elk putje. Maak drie kanalen beelden van elke afbeelding triplet. In een dergelijke afbeelding fluorescerende cytoplasma kunnen samen gezien worden met de celmembranen. Gefuseerde cellen kan dus eenvoudig worden bepaald [Figuur 1]. Tellen alle drie de typen cellen (rood, groen en duaal TL) in elk drie kanalen beeld. Bepaal het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen door het aantal van de tweevoudig fluorescerende cellen met het aantal van alle cellen in elk beeld. Fusion opbrengst is gedefinieerd als het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen vermenigvuldigd met twee, omdat de helft van de gefuseerde cellen worden niet gedetecteerd (als cellen van dezelfde kleur zekering). Representatieve resultaten Figuur 1 Drie kanaal microscopie beeld van B16F1 cellen na elektrolas:. Fase contrast, CMRA fluorescentie (excitatie bij 548 nm) en CMFDA fluorescentie (excitatie bij 492 nm), objectieve vergroting 20x