Cell Block получение из цитологии образцов с преобладанием индивидуально отдельные клетки

Введение: Это видео описании метода Shidham для ячейки блока препарат из жидкого цитология (LBC) образец использования HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). По сравнению с другими случайными подходы, следующие два важнейших особенностей этого протокола для приготовления клеточных блоков из относительно hypocellular образцов с однократно рассеянного свободные клетки (1-5). Этот протокол включает в себя шаги, чтобы сосредоточиться ячеек по плоскости, параллельной резки поверхности клетки блока. Она также включает маяк, как темные включения AV-маркер (рис. 1б), который служит двум из следующих целей: Чтобы представить себе уровень, при котором клетки сосредоточены. Площадь ячейки блока с клетками интерес в настоящее время могут быть визуализированы histotechnologist когда темные маяк подвергается в процессе резки. Эта способность контролировать бы предотвратить один из прорезая уровне с большинством клеток, или не разрезая слишком поверхностно на уровне с высокой концентрацией образец клеток. Чтобы служить в качестве отправной точки локатор ссылки в разделе серийного блока ячейки на разных слайдах. Эта контрольная точка действует как маяк, чтобы помочь найти конкретный клетки или группы клеток для оценки картины координировать иммунореактивности с СКИП подход (6,7). ПРОТОКОЛ (рис. 2) Подготовка образца. Передача остаточной LBC цитология шейки матки образца к плоской трубки со стеклянным дном (15 мм диаметр х 45 мм) (Рисунок 2.1 по 2.4). Место стеклянной трубки в большую пластиковую трубку носитель (28 х 85 мм) и центрифуги. Снимите трубку со стеклянным дном от несущей трубой и слить супернатант. Стеклянная трубка, то ограничен (для предотвращения утечки горячей воды в следующем шаге) и поместили обратно в большую плоскую трубку перевозчика пластиковым дном Трубки перевозчик пластиковых содержащие стеклянную трубку, затем ограничен, размещенных в центрифуге (с поворотным чашки, а не фиксированной чашки так, чтобы угол падения клетки перпендикулярно к плоской нижней части стеклянной трубки) и центрифугировали при 1805 G (3000 RPM, радиуса ротора-17см) в течение пяти минут (рис. 2.5). Трубы затем удаляются вертикально от центрифуги и меньше стеклянной трубки удаляется пинцетом из больших пластиковую трубку перевозчика, не нарушая осевших гранул с ячейками. Стеклянную трубку с образца без колпачков и супернатант сливают осторожно, чтобы не мешать плоский слой осадка клетки в нижней части (рис. 2.6). Включение ссылки координировать AV-маркер и того геля Темный маяк AV-маркер (около 2 мм х 2 мм, плоская поверхность, фрагмент темного цвета, sectionable материала) (рис. 3) добавляется в качестве указателя на стеклянную трубку (рис. 2.7). Liquefy аликвоту HG путем плавления его в микроволновой печи в течение 10 секунд при средней мощности. Добавить 0,5 мл расплавленного HG к трубке, смешивается с осадком быстро, и повторение его (рис. 2.8) (Перейдите к следующему шагу, быстро, не позволяя HG начала затвердевания). Добавить около 2,5 мл теплой (45 ° С) водой пластиковую трубку носителя (рис. 2.9). Меньше ограничен стеклянной трубки находится внутри пластиковой трубки с теплой водой. (Этот шаг необходим, чтобы держать HG от затвердевания в течение следующих шагах) (рис. 2.9). Трубки перевозчик пластиковых помещается в центрифугу (с поворотным чашки, а не фиксированной чашки так, чтобы угол падения клетки перпендикулярно к плоской нижней части стеклянной трубки) и центрифугировали при 1805 G (3000 оборотах ротора радиус-17см) в течение пяти минут. Цель этого центрифугирования шагом будет толкать AV-маркер и сосредоточиться клеток в слое ближе к режущей поверхности окончательного парафин ячейки блока (рис. 1г). Трубы затем удаляются нежно и по вертикали от центрифуги заботясь, чтобы не мешать осаждают тонкий слой с образцами клеток на дно. Большие пластиковые трубки без колпачков и меньше стеклянной трубки удаляется по вертикали щипцами, не нарушая слоя осадка образца клеток. Небольшая стеклянная трубка охлаждается в вертикальном положении в течение 15 минут, чтобы охладить и укрепить HG (рис. 2.11). Удаление ячейки блока в виде кнопки геля с образцами для окончательной обработки Затвердевших HG диск, со слоем концентрированной / осадка образца на дно выбили из плоской стеклянной трубки нижней, впрыскивая 10% формалина через 23 иглы со шприцем (рис. 2.12). Игла вводится вдоль боковой трубкой на периферии затвердевших HG диск с образцами (рис. 2.12). Needlэлектронной поворачивается вдоль боковой трубкой в ​​то время как формалин медленно протолкнул шприц. Это приводит к разделению HG кнопку вместе с темным маяком AV-маркер и концентрированного образца в нем с плоским дном из стеклянной трубки (рис. 2.12). Ячейки блока (гель кнопку с образцами клеток), затем помещается в меченых кассеты и представлены для обработки ткани для подготовки парафин ячейки блока (рис. 2.13). Вложения и резки образца Диск в парафин с темной стороной маркерного радиомаяка поста режущей поверхности (рис. 1). Блок подразделяется пока темные AV-маркера в качестве маяка подвергается и четко видны. От трех до четырех разделов микрон вырезаны из этого уровня, которое должно содержать большую часть однократно рассеянного клеток из образца. Разделах собраны на предметное стекло для дальнейшего окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, или другие тесты, как указано. Протоколы этих испытаний, включая тип слайды использовать для установки секций может варьироваться. В общем, для иммунной, с покрытием слайды используются для предотвращения плавающей и потере разделов из слайдов во время иммунной шагов. Сокращения, используемые (в алфавитном порядке): CISH, хромогенных на месте тесты гибридизации, рыба, флуоресцентная лампа на месте тесты гибридизации; FFPE, формалин-фиксированных парафин; FNA, тонкая аспирационная биопсия, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, жидкие цитология, ПЦР-полимеразная цепная реакция; Рисунок 1. Структуры клеточных блок подготовленный протокол Shidham в. Рисунок 2. Резюме различные шаги для приготовления клеточных квартале от LBC образца по протоколу Shidham в. Рисунок 3. Подготовка AV-маркер из банановой кожуры. Рисунок 4. Сравнение ячейки блоков и секций с и без AV-маркер. Рисунок 5. Сравнение клеточности разделам клеточной блок с и без AV-маркер.