सेल तैयार: पहले परख, संस्कृति और विकास मीडिया में न्यूरॉन्स / astrocytes के लिए सेल बोने के लिए जब तक ~ 70-80% मिला हुआ है (सेल पिघलना या अलगाव से सीधे बीज बोने की क्रिया जब तक). ब्याज की कोशिका प्रकार के लिए उपयुक्त विधि के माध्यम से संस्कृति बोतल / प्लेटों से कोशिकाओं को अलग. यदि आवश्यक हो, पाली – डी lysine या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कोट परख थाली कुओं कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए. सह astrocytes और न्यूरॉन्स की संस्कृतियों को एक साथ या sequentially वरीयता प्राप्त हो सकता है. अनुक्रमिक seedings के लिए, एक "बेसल" परत के रूप में पहला astrocytes के चढ़ाना की सिफारिश की है, neuronal चढ़ाना और भेदभाव के द्वारा पीछा किया, यदि आवश्यक हो,. कोशिका प्रकार, बाद में संस्कृति के समय, ब्याज के मापदंडों के लिए उपयुक्त के रूप में सेल घनत्व को समायोजित करने के लिए, आदि संस्कृति उम्र पर निर्भर करता है, सेल स्रोत और बोने घनत्व, प्राथमिक संस्कृतियों, GFAP अभिव्यक्ति या neurite परिणाम प्रसार की दर में काफी भिन्न हो सकते हैं – यह करने के लिए महत्वपूर्ण है विशेषताएँ और अपने सेल प्रणाली का अनुकूलन करने के लिए अपने प्रयोगात्मक मॉडल के लिए सबसे जैविक प्रासंगिकता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रभावी इमेजिंग, विभाजन और विश्लेषण HCS (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर के लिए प्रदान प्रदान. प्लेट (कोशिकाओं को 90 μL मीडिया में वरीयता प्राप्त हो सकता है, विष उपचार की सुविधा के रूप में नीचे तीन चरण में वर्णित) के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के बाद, प्लेट एक स्तर की सतह पर कमरे के तापमान पर बैठने के लिए 15-30 मिनट के लिए, यहां तक कि सेल वितरण को सक्षम करने की अनुमति. इस अवधि के बाद, विकास मीडिया में कम से कम 24 घंटे के लिए सेते कोशिकाओं (37 ° C / 5% सीओ 2), तो भेदभाव संस्कृति शर्तों पर स्विच करने के (जैसे, कम सीरम / NGF PC12 कोशिकाओं के लिए), के रूप में उपयुक्त है. संस्कृति जारी रखें जब तक कोशिकाओं संगम या भेदभाव के वांछित स्तर तक पहुँचने, सेल प्रकार के लिए उपयुक्त अंतराल पर मीडिया को बदलने. सेल उपचार (नियंत्रण यौगिकों, परीक्षण यौगिकों, आदि) इस संस्कृति की अवधि के दौरान किसी भी बिंदु पर शुरू किया जा सकता है, ब्याज के उपचार के समय पाठ्यक्रम के लिए उपयुक्त के रूप में. Acrylamide, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और कश्मीर 252a neurotoxic नियंत्रण यौगिकों के रूप में प्रदान की जाती हैं. पर्याप्त अभिकर्मकों डुप्लिकेट सभी पाँच 96 अच्छी तरह प्लेटें के लिए 12 सूत्री खुराक प्रतिक्रिया घटता (एक DH 2 हे या DMSO खुराक प्रतिक्रिया के भीतर नियंत्रण सेट सहित) के लिए प्रदान की जाती हैं. यौगिकों 250X (कश्मीर 252a के लिए, 1 सुक्ष्ममापी की एक अधिकतम उपचार संभालने) एकाग्रता या 10X (acrylamide और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लिए, 100 मिमी और 10 मिमी, क्रमशः की अधिकतम उपचार संभालने) पर प्रदान की जाती हैं. की सिफारिश की उपचार आधा लॉग तैयारी शामिल है (1: 10 √) DMSO में 250X परिसर के धारावाहिक कमजोर पड़ने, यौगिक कमजोर पड़ने बफर में कमजोर पड़ने द्वारा पीछा 10X (10X नियंत्रण DH 2 हे में प्रारंभिक यौगिकों serially बाँझ DH हे दो में किया जा सकता है सीधे पतला या मिश्रित कमजोर पड़ने बफर). प्रत्येक उपचार के 10 μL तो पहले से ही एक अच्छी तरह से मौजूद संस्कृति मीडिया के 90 μL जोडा जा सकता है एक अंतिम 1X एकाग्रता (0.4% DMSO या 10% DH 2 हे) के लिए हो. नमूना डेटा यौगिक उपचार के 24 या 96 घंटे के लिए 37 पर ° सी से पहले निर्धारण करने के लिए प्रदान की जाती है. सेल फिक्सेशन और Immunofluorescent धुंधला: नोट: समय धुंधला ~ 2.5 बाद निर्धारण घंटे है. कुओं धुंधला कदम के बीच शुष्क करने की अनुमति नहीं है . आकांक्षा और अभिकर्मकों के ऋण वितरण के कम प्रवाह दरों पर आयोजित किया जाना चाहिए किसी भी सेल द्रव कतरनी की वजह से नुकसान कम . सभी संस्करणों 'अच्छी तरह से प्रति' सिफारिश की एक 96 – अच्छी तरह से microplate की एक अच्छी तरह से एकल देखें . मात्रा 'सभी 96 अच्छी तरह से थाली के अनुसार' की सिफारिश की तरल से निपटने की मात्रा घटाने के लिए 25% अधिक शामिल हैं. सभी धुंधला कदम कमरे के तापमान (आर टी) पर प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी buffers और एंटीबॉडी समाधान आरटी पर कम से कम 24 घंटे के लिए स्थिर रहे हैं . संस्कृति की अवधि के अंत में, पूर्व गर्म HCS फिक्सेशन कमरे तापमान (आर टी) या 37 º सी करने के लिए समाधान (2X) अगर वांछित (12 mL/96-well थाली). एक रासायनिक धूआं हुड में / अच्छी तरह से सीधे संस्कृति मीडिया 100 μL जोड़ने और आरटी पर 30 मिनट के लिए तय की अनुमति है. लगानेवाला / विष से युक्त मीडिया निकालें और खतरनाक कचरे के लिए नियमों के साथ अनुपालन में के निपटान (MSDS देखें). यदि धुंधला हो जाना करने के लिए तुरंत आगे बढ़ने से, प्रत्येक दो बार अच्छी तरह कुल्ला HCS immunofluorescence बफर के 200 μL के साथ. वैकल्पिक रूप से, अगर प्लेटों को एक बाद में समय पर दाग हो रहे हैं, धो बफर के 200 μL के साथ दो बार कुल्ला, तो दूसरा खंड के कुओं और दुकान धुंधला हो जाना जब तक 4 º सी में कसकर मोहरबंद प्लेटें में कुल्ला छोड़. यदि तय नमूने 4 º धुंधला पहले सी पर संग्रहित किया गया है, 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले दो बार कुल्ला. निम्नानुसार खरगोश एंटी – βIII / ट्यूबिलिन माउस विरोधी GFAP HCS प्राथमिक एंटीबॉडी (6 mL/96-well थाली) के समाधान काम तैयार: HCS immunofluorescence बफर के 5.88 एमएल प्रत्येक thawed प्राथमिक एंटीबॉडी के 60 μL जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स. पिछले immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. एक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL जोड़ें और आरटी से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालेंसमाधान. 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ तीन बार कुल्ला करें. निम्नानुसार HCS माध्यमिक एंटीबॉडी / Hoechst HCS परमाणु दाग (6 mL/96-well प्लेट) का काम कर समाधान तैयार: प्रत्येक thawed माध्यमिक एंटीबॉडी के 30 μL और thawed Hoechst HCS परमाणु के 30 μL HCS immunofluorescence बफर के 5.91 एमएल दाग जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स, प्रकाश से समाधान की रक्षा. पिछले HCS immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. HCS माध्यमिक एंटीबॉडी / Hoechst HCS परमाणु दाग समाधान के 50 μL जोड़ें और आरटी, प्रकाश से संरक्षित 1 घंटे के लिए सेते हैं. HCS माध्यमिक / एंटीबॉडी Hoechst HCS परमाणु दाग समाधान निकालें. 200 μL HCS immunofluorescence बफर के साथ दो बार कुल्ला. पिछले HCS immunofluorescence बफर कुल्ला निकालें. HCS धो बफर के 200 μL के साथ दो बार कुल्ला, कुओं में दूसरी कुल्ला मात्रा छोड़ने. 4 º सी में सील की थाली और छवि तुरंत या दुकान, प्लेट इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक प्रकाश से रक्षा की. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण: इमेजिंग और दाग प्लेटों के विश्लेषण सहित सेल विश्लेषक में (जीई हेल्थकेयर) उपलब्ध HCS प्लेटफार्मों, ArrayScan (ThermoFisher वैज्ञानिक) या ओपेरा (Perkin एल्मर) की एक किस्म पर प्रदर्शन किया जा सकता है. तालिका 1 में इमेजिंग और विश्लेषण के लिए कुछ दिशा निर्देश प्रदान की जाती हैं: HCS222 छवि अधिग्रहण दिशानिर्देश जांच अभिकर्मक उद्देश्य लेंस उत्तेजना फ़िल्टर रेंज [चोटी / बैंडविड्थ (एनएम)] उत्सर्जन फ़िल्टर रेंज [चोटी / बैंडविड्थ (एनएम)] Hoechst HCS परमाणु दाग 20X 360/40 460/40 (या यदि आवश्यक 535/50) HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, FITC – गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 20X 480/40 535/50 HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, Cy3 – गधा विरोधी माउस आईजीजी 20X 535/50 600/50 HCS222 छवि विश्लेषण दिशानिर्देश सेल पैरामीटर खोज / विभाजन मापन दलील सेल नंबर, परमाणु अभिलक्षण Hoechst HCS परमाणु दाग परमाणु क्षेत्र (460 एनएम उत्सर्जन चैनल). नाभिक की संख्या की गणना. डीएनए सामग्री (परमाणु तीव्रता) या परमाणु क्षेत्र विश्लेषण भी संभव है. सेल नंबर, परमाणु विशेषताओं का प्रयोग करें "फिल्टर" βIII ट्यूबिलिन या GFAP अभिव्यक्ति के साथ जुड़े अलग neuronal और astrocytic सेल मायने रखता है / characterizations (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए नाभिक सेल हानि, विषाक्तता phenotypes, आदि का निर्धारण. βIII ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति, neurite परिणाम HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, FITC संयुग्मित Cytoplasmic क्षेत्र (535 एनएम उत्सर्जन चैनल). FITC संकेत neurites (उदाहरण के लिए, न्यूनतम / औसत सेल शरीर क्षेत्रों, न्यूनतम / अधिकतम neurite लंबाई और widths के माध्यम से) से neuronal सेल निकायों भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल neurite लंबाई, neurite मायने रखता है / सेल, आदि जैसे मानकों का निर्धारण Neurite परिणाम माप neuronal भेदभाव के दौरान या रासायनिक चोट, रोग राज्यों, आदि का एक परिणाम के के रूप में modulated किया जा सकता है "फिल्टर" βIII – ट्यूबिलिन अभिव्यक्ति के साथ जुड़े अलग neuronal लक्षण वर्णन (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए सेल शरीर. GFAP अभिव्यक्ति, astrocyte क्षेत्र HCS माध्यमिक एंटीबॉडी, Cy3 संयुग्मित Cytoplasmic क्षेत्र (600 एनएम उत्सर्जन चैनल). Cy3 संकेत astrocytic cytoplasmic विभाजन को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. औसत cytoplasmic संकेत तीव्रता, सेल क्षेत्र, आदि जैसे मानकों का निर्धारण GFAP अभिव्यक्ति और astrocyte सेल क्षेत्र astrocyte विकास के दौरान या रासायनिक चोट, रोग राज्यों का एक परिणाम के के रूप में modulated किया जा सकता है, आदि GFAP अभिव्यक्ति के साथ जुड़े करने के लिए अलग astrocytic लक्षण वर्णन (पुरजोर सिफारिश की है) प्राप्त लोगों के लिए सेल निकायों "फिल्टर". HCS222 βIII-Tubulin/GFAP परख (सह – संस्कृति) – टेबल 1 छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दिशानिर्देश प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1. βIII ट्यूबिलिन और GFAP immunofluoreमिश्रित चूहे तंत्रिका कोशिका संस्कृतियों के scence. या तो प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स या चूहा PC12 कोशिकाओं के साथ प्राथमिक चूहे hippocampal astrocytes के सह संस्कृतियों संस्कृति में कई दिनों बाद neuronal बोने द्वारा पूर्व चढ़ाना astrocytes द्वारा उत्पन्न किया गया. प्राथमिक न्यूरॉन्स एक अतिरिक्त 11 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे, जबकि PC12s भेदभाव शर्तों (कम सीरम / NGF) के तहत एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे. सेल से निपटने के निर्धारण, और immunostaining HCS222 परख प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. कक्ष जीई पर सेल विश्लेषक 20X (प्राथमिक न्यूरॉन्स) या 10X (PC12) उद्देश्य बढ़ाई 1000 (3.3) में imaged थे और सेल विश्लेषक 1000 (3.4) कार्य केंद्र neurite परिणाम और मल्टी लक्ष्य विश्लेषण एल्गोरिदम में जीई का उपयोग करने का विश्लेषण उच्च पैनल. Hoechst HCS दाग परमाणु (नीला), βIII ट्यूबिलिन () हरे और GFAP प्रतिदीप्ति (लाल) के इनकार छवियाँ. (सेल शरीर नीला (प्राथमिक न्यूरॉन्स में उल्लिखित) या पीला (PC12), (प्राथमिक न्यूरॉन्स) हरे या प्रकाश (PC12) नीले में neurites मध्य पैनल) प्रतिदीप्ति βIII ट्यूबिलिन चैनल के अलग विश्लेषण neurite परिणाम विभाजन के लिए अनुमति देता है. GFAP चैनल के विश्लेषण astrocyte विभाजन (: नाभिक नीले, हरे रंग में cytoplasm में उल्लिखित नीचे पैनल) के लिए अनुमति देता है . (-) प्राथमिक चूहे hippocampal / न्यूरॉन astrocyte सह संस्कृति के लिए GFAP विभाजन नाभिक / सेल शरीर है कि GFAP (+) (हरे रूपरेखा) हैं और उन है कि GFAP हैं के बीच भेद करने की क्षमता को दर्शाता है (लाल), के लिए अलग सेल की गिनती को सक्षम एक मिश्रित संस्कृति की स्थापना में न्यूरॉन्स और astrocytes. चित्रा 2. प्राथमिक चूहे की खुराक प्रतिक्रियाओं hippocampal न्यूरॉन / astrocyte विषाक्त तनाव सह संस्कृतियों. प्राथमिक चूहे hippocampal astrocytes (P6) 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वृद्धि मीडिया में चढ़ाया गया और 6 दिनों के लिए सभ्य है. प्राथमिक चूहे hippocampal न्यूरॉन्स (प्रत्यक्ष पिघलना से) तो पूर्व चढ़ाया astrocytes के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त थे और विकास मीडिया में 11 दिनों के लिए सुसंस्कृत. कक्ष संस्कृति के पिछले 24 घंटे के लिए acrylamide या हाइड्रोजन पेरोक्साइड (अधिकतम सांद्रता = 100mm और 10mm क्रमशः) के धारावाहिक dilutions के साथ इलाज किया गया. सेल से निपटने के निर्धारण, और immunostaining HCS222 परख प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया. कक्ष जीई पर सेल विश्लेषक 20X (10 क्षेत्रों / अच्छी तरह से) 1000 (3.3) में imaged थे और (परमाणु / cytoplasmic / neurite विभाजन) विश्लेषण सेल विश्लेषक 1000 (3.4) कार्य केंद्र neurite परिणाम और मल्टी लक्ष्य विश्लेषण एल्गोरिदम में जीई का उपयोग कर. प्रस्तुत डाटा ± SEM, n = 3 मतलब हैं. खुराक पर निर्भर रुझान के लिए एकाधिक मापदंडों (neurite परिणाम, GFAP तीव्रता, astrocyte क्षेत्र और neuronal या astrocytic कोशिकाओं की गिनती) जांच की गई.