Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석
Summary
이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.
Abstract
하이 컨텐츠 분석 (HCA) assays은 단일 분석에서 여러 세포 phenotypes의 측정을 수 있도록 자동 이미징과 강력한 이미지 분석 알고리즘 세포 검출 시약을 결합. 본 연구에서는, 우리는 neurotoxicity에 대한 소설 분석을 개발하는 HCA를 활용. Neurotoxicity 평가는 중요한 약물 안전 평가의 일부뿐만 아니라, 환경 보호 노력의 중요한 초점이되고를 나타냅니다. 또한, neurotoxicity는 잘 접수<em> 체외에서</em등 알츠하이머와 파킨슨병의 질병으로 neurodegenerative 질병의 개발> 마커. 최근의 연결을 검사하기 위해 HCA의 신청이보고되었습니다. βIII – tubulin로의 연결을 세포를 분류하여, HCA의 assays은의 연결 번호, neurite 개수 및 neurotoxic 효과를 나타낼 수있는 모든있는 neurite의 길이로 매개 변수의 높은 처리량이 아닌 주관적인, 양적 측정을 제공할 수 있습니다. 그러나, astrocytes의 역할은이 모델에서 미개척 남아 있습니다. Astrocytes는 중추 신경계 (CNS) 항상성의 유지에 중요한 역할을 가지고 있고, 그들이 독성 물질 또는 질병 상태에 대한 응답으로 활성화됩니다 neuroprotection 및 neurodegradation 모두와 관련됩니다. GFAP는 CNS의 astrocytes에 주로 표현 중간 필라멘트 단백질이다. Astrocytic 활성화 (gliosis)은 일반적으로 증식과 비대 astrocyte 함께 GFAP의 upregulation에 연결됩니다. 반응 gliosis의이 과정은 신경계 손상의 초기 마커로 제안되었습니다. GFAP의 quantitation에 대한 전통적인 방법은 면역입니다. 이러한 접근 방식은 셀룰러 현지화, 형태학 및 휴대폰 번호에 대한 정보를 제공하는 무능력에 의해 제한됩니다. 우리는 HCA 이러한 한계를 극복하기 위해 동시에 gliosis와 관련된 여러 기능을 측정하는 데 사용될 수 있다고 결정 – GFAP 표현의 변화, astrocyte 비대하고, astrocyte 확산 – 단일 분석 이내에 있습니다. 공동 문화 연구에서, astrocytes는 독성 모욕 여러 종류에 대해 신경을 보호하고 비판적으로의 연결을 생존에 영향을 보여왔다. 최근 연구 제안했다고에서 astrocytes의 사용<em> 체외에서</em> neurotoxicity 테스트 시스템은 혼자의 연결을 세포보다 인간 CNS 구조와 기능 관련성이 될 수 있습니다. βIII – tubulin과 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 프로 파일링을위한 따라서, 우리는, 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 HCA 분석을 개발 프로토콜의 구성과 검증 있고, 타겟 특정 검색 시약. 이 분석은 neurotoxicity 평가가 아닌 주관적인, 높은 처리량 분석 소설을 대표하는 neurotoxicity의 동시 분석, neurite의 파생물, gliosis, 세포 모델의 다양한의 연결 및 astrocytic 형태학 및의 연결 및 astrocytic 개발을 수 있습니다. 분석은 신경 과학 연구 및 약물 발견에 neurotoxicity와 생산성 향상의 향상된 검출을위한 잠재력을 보유하고 있습니다.
Protocol
Discussion
지금까지, 뉴런과 astrocytes의 혼합 문화를 사용하여 neurotoxicity 위험 평가를 공부하기위한 체외 실험에서 제한되었습니다. 그것은 glial 세포가 뉴런에 공간과 신진 대사 지원을 제공 통합하고 있으며,의 연결을 마이 그 레이션, 분화와 시냅스 활동을 포함한 여러 modulating의 연결 기능에 중요한 역할을 것을 잘 허용됩니다. Glial astrocytes 또한 크린 시토킨 많은 독소의 양쪽의 연결 조직을 둘러싼에 불리한 반응을 유도뿐만 아니라 홍보의 연결을 허용 수있는 다른 가용성 요소를 놓습니다. 이러한 항산화 방어하고 세포의 에너지 수준의 유지 보수와 같은 astrocytic 기능의 장애가로 표시되었습니다 반면에의 연결 – glial 상호 작용의 깊이를 보여주는, 공동 문화 연구에 astrocytes은 산화 스트레스의 독성에 대한 뉴런을 보호하기 위해 표시되었습니다 비판적으로의 연결을 생존에 영향을 미칩니다. 최근 연구는 체외의 neurotoxicity 테스트 – 시스템에 astrocytes의 사용 혼자의 연결을 세포보다 인간의 중추 신경계의 구조와 기능 관련성이 될 수 있습니다 것을 제안했습니다. 의 연결 – astrocytic 상호 작용의 생리적 의의의 성장 인식에도 불구하고, 그것은 이전 그대로 세포에서 이러한 상호 작용의 양적 분석을 수행하기 어려운되었습니다. 하이 컨텐츠 스크리닝의 출현은 강력한 새 assays의 개발이이 문제를 해결할 수 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 하나의 분석에서 여러의 연결 및 astrocytic phenotypes의 양적 분석은 HCA에 의해 가능하게 한 것을 증명하고있다. 기본 뉴런에서 우리는의 연결 번호, neurite 카운트와 neurite 길이로 neurotoxicity 마커의 양적 측정을 수행했습니다. astrocytes에 반응 gliosis는 GFAP 표현, astrocyte 번호 astrocyte 형태의 변경에 의해 특징 neurotoxicity의 알려진 biomarker입니다. 우리는이 끝점 각각이 쉽게 HCA를 통해 평가 수 증명하고있다. 이 연구는 신경 특정 생체 HCA가 급속하게 neurotoxic 종점에 대한 화학 물질의 큰 숫자를 화면으로 체외 테스트에의 배터리의 일환으로 사용될 수있는 개념을 지원합니다.
뉴런과 astrocytes의 공동 문화 Millipore의 HCS222 하이 컨텐츠 분석 키트는 고품질 탐지 시약 동시에 neurotoxicity의 세포 모델의 다양한 βIII – tubulin과 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 프로 파일링을위한 프로토콜로 구성되어 있습니다. 이 키트와 함께 제공되는 높은 유효 시약은 사용자가 assays을 표준화 분석 – 투 – 분석 변화를 최소화하고, reproducibly 높은 신호 대 배경 비율로 이미지를 생성하실 수 있습니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 DRS 감사하고 싶습니다. 릭 라이언, Umesh 파텔, 제프까지, 매튜 수의, Jehangir Mistry 이러한 프로젝트 및 프로토콜의 개발 기간 동안 지원 미쉘 Hatler.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hoechst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 µL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
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| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 µL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 µL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 µL of 250 µM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | ||||
| HCS imaging/analysis system |
Referencias
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O’Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?. Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
